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Instituto Politécnico NacionalUnidad Profesional Interdisciplinaria deIngeniería Campus GuanajuatoLaboratorio de Biotecnología Molecular5BVPráctica 8. “Electroforesis de proteínas en condicionesdesnaturalizantes SDS-Page”Equipo No. 6Integrantes:Alvarado Cerda, Mitzi JocelynGabriel Flores, KarinaHern...

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Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería Campus Guanajuato

Laboratorio de Biotecnología Molecular 5BV1 Práctica 8. “Electroforesis de proteínas en condiciones desnaturalizantes SDS-Page” Equipo No. 6 Integrantes: Alvarado Cerda, Mitzi Jocelyn Gabriel Flores, Karina Hernández Montesinos, Itzel Yoali Lara Pérez, Elizabeth Rougon Flores, Marina Vanessa Vargas Avila,Miriam Isabel

Profesores Dr. César Aza González Dra. Karla Lizbeth Macías Sánchez Dr. Juan Francisco Sánchez López

Silao de la Victoria, Gto., Martes 29 de Noviembre del 2016

Objetivo General: ● Realizar la técnica de electroforesis SDS-Page Objetivos específicos: ● Preparación de muestra de sangre 1-10 y 1-100 para visualización en gel SDS-Page. ● Separación de proteínas de la muestra de sangre (1-10) en SDS-Page.

Resultados: Posterior a la preparación de las respectivas muestras de cada equipo, se realizó el montaje del sistema y la preparación del gel. Se cargaron 30µL de cada muestra. En la figura 1 se puede observar el gel en el momento de la electroforesis, donde se presentan dos coloraciones, una azul y una segunda de color rosa. En la figura 2 se pueden observar los resultados de las corridas de las muestras de cada equipo en el gel de poliacrilamida. El carril 3 corresponde a la muestra del equipo (dilución 1:10 plasma sanguíneo).

Figura 1. Gel de poliacrilamida durante la electroforesis.

Figura 2.. Visualización de electroforesis en gel SDS-Page. Carril 3: muestra de sangre (dilución 1:10) equipo 6; Carril 9: marcador de peso molecular Benchmark protein Ladder con capacidad de 10-220  kDa. Las líneas rojas muestran la distancia entre las bandas del marcador

Se observa en la figura que existe un desvanecimiento en todas la muestras desde el gel concentrador, así como bandas poco definidas y asimétricas correspondientes a la muestra del equipo, sin embargo existe una zona con mayor intensidad de color entre los 15 y 16.5 cm. Por otro lado, el carril 9 se cargó con un marcador de peso molecular Benchmark protein Ladder con capacidad de 10-220 kDa en el que se observan bandas más definidas y ningún desvanecimiento en el gel concentrador. Considerando las bandas del marcador molecular que se pudieron visualizar, se midió la distancia de estas y se relacionó con la distancia total del gel de la siguiente manera: Distancia que recorrió la proteína M ovilidad Relativa = Distancia hasta donde migró el frente del gel Observando la figura 2, se aprecia que la distancia que migró el frente del gel fue de aproximadamente 3.63 cm. En la siguiente tabla se muestra la distancia recorrida por las proteínas del marcador molecular, así como los resultados de las distintas movilidades relativas y los cálculos del logaritmo base diez de los pesos moleculares de las bandas.

Tabla 1. Datos considerados para la curva del Marcador utilizado (BenchMark Protein Ladder).

Al graficar el log10 de los pesos del Marcador molecular BenchMark Protein Ladder contra la movilidad relativa previamente calculada (figura 2), se obtuvo la ecuación lineal y= -1.3391 + 2.2411con una correlación lineal de 0.93737

Figura 3. Curva de calibración del marcador BenchMark Protein Ladder para la determinación de pesos moleculares de las proteínas presentes en la muestra de plasma sanguíneo.

Figura 4. Visualización de electroforesis en gel SDS-Page. Carril 3: muestra de sangre (dilución 1:10) equipo 6; Carril 9: marcador de peso molecular Benchmark protein Ladder con capacidad de 10-220  kDa. Las líneas rojas muestran la distancia entre las bandas observadas en la muestra de sangre.

Para calcular el peso molecular de las bandas presentes en la muestra (figura 3), se calculó la Rf de cada banda y se interpoló en la ecuación de regresión obtenida en el gráfico anterior (figura 2), dando como resultado la siguiente tabla. Tabla 2. Datos para calcular el peso molecular de las bandas en las muestra de plasma sanguíneo utilizando la curva patrón realizada con el marcador molecular.

Discusiones: Durante la electroforesis en el gel se observan dos coloraciones (figura 1), una azul y una rosa, la azul se le atribuye al colorante azul de bromofenol que es un componente del buffer de carga y su uso es como marcador para poder observar el frente de la movilidad de las proteínas durante la electroforesis, el color rosa, Cardos (2000), menciona que puede ocurrir un progresivo cambio de color azul a rosa debido a la naturaleza de las proteínas, es decir esto ocurre cuando las proteínas tienen un alto contenido de prolina además de tener secuencias de aminoácidos altamente repetitivas (Cardos, 2000). Según el manual de protocolos y técnicas de Cultek para electroforesis, el tamaño de poro de los geles de poliacrilamida viene determinado por la concentración total de monómeros. Así, un gel de poliacrilamida se define por el reticulado (%T) que es la concentración total de monómeros (acrilamida + bisacrilamida; % p/v), así mismo, la relación lineal entre el logaritmo base 10 del peso molecular y la movilidad relativa de las bandas, se mantiene para una concentración dada de poliacrilamida al 30% y sólo en un corto intervalo de peso molecular. De forma general, en geles del 15%T la relación lineal es válida para proteínas comprendidas entre 12 y 45 kDa; en geles del 10%T, el intervalo lineal va entre 15 y 70 kDa, y en los del 5%T, entre 25 y 200 kDa. Siendo que se usó acrilamida al 30% para llegar a un concentración final de 12% en el gel separador, se graficó la distancia recorrida contra el peso molecular de las bandas del marcador para verificar en qué punto se pierde la linealidad (figura 5).

Figura 5. Relación PM vs. distancia recorrida en las bandas del marcador

Como se puede observar, la linealidad se conserva de 25 a 100 kDa, por lo que se repitió el ajuste anterior (figura 3) ahora en el intervalo antes mencionado. Así mismo, en la curva con el nuevo ajuste (figura 6), se obtuvo una mejor correlación al eliminar los puntos que no conservaban la linealidad, siendo esta de 0.99606.

Figura 6. Curva de calibración del marcador BenchMark Protein Ladder para la determinación de pesos moleculares de las proteínas presentes en la muestra de plasma sanguíneo con intervalo de 25 a 100 kDa.

De igual forma, se obtuvo el valor de los pesos moleculares de las bandas en la muestra de sangre utilizando la ecuación del nuevo ajuste (tabla 3). Tabla 3. Datos para calcular el peso molecular de las bandas en las muestra de plasma sanguíneo utilizando la curva patrón realizada con el marcador molecular en el intervalo de 25 a 100 kDa.

Para la realización de este tipo de separación se emplea un sistema de dos geles: concentrador (stacking) y separador (resolving). El gel concentrador (menor concentración) presenta un tamaño de poro grande, de esta manera se permite la concentración de la proteína en una banda estrecha, antes de ser separadas por su tamaño y carga en el gel separador; su pH es dos unidades menos comparado con el gel de separación, esto con el propósito de provocar que la carga se transporte más por las proteínas que por el buffer de electroforesis (Roca et al, 2004). Como puede observarse en la figura 2 y figura 4, existe una banda desvanecida dentro del gel en todas las muestras a excepción del marcador, dicho comportamiento puede sugerir que el error no se encuentra como tal en la preparación de los geles debido a que el marcador se presenta de manera diferente, sino más bien a algún efecto relacionado con el tratamiento de las muestras. Se realizó una dilución 1:1 de las muestras con buffer de carga (procedimiento que no se realizó para el marcador) por lo que siendo ésta la única variable distinta en ambos casos, se atribuye el desvanecimiento de las muestras a este componente. García (2000) menciona que la fuerza iónica del sistema tampón debe mantenerse a un nivel adecuado para garantizar la solubilidad de la muestra y suficiente capacidad amortiguadora. Es usual utilizar concentraciones de tampón en un rango entre 0,025 y 0,1 mol/L, pero pueden emplearse concentraciones sobre 0,5 mol/L en sistemas fuertemente ácidos, pues a bajos valores de pH muchos ácidos débiles (que son los más empleados) están débilmente ionizados y es necesaria una alta concentración para obtener la adecuada capacidad amortiguadora. Durante la realización de la práctica no se midió el pH del buffer (solución tampón) ni se aseguró que la preparación fuera la correcta o su caducidad, es por ello que posiblemente alguno de estos factores sea el responsable de algún efecto en el buffer que impidiera su correcto corrimiento y presentase resultados barridos como se observa en las figuras. Este mismo autor menciona que en la electroforesis, los efectos de absorción de agua, no-homogeneidad del material, intercambio iónico con grupos cargados del soporte y electroendósmosis, pueden influir sobre la movilidad y la calidad de la separación, por lo que la preparación de las muestras pudo haber presentado uno o varios de estos efectos y evitado el correcto corriemiento y definición de bandas en el gel. Otra posible causa de la difusión de las bandas es la variación de temperatura durante la corrida electroforética ya que durante la electroforesis que se realizó hubo un cambio del voltaje de 80 a 120 V.,la energía eléctrica se convierte en calor y esto puede provocar además el efecto de sonrisa en la parte inferior del gel (Carrillo et al, 2013).

Sangre Se prepararon dos diluciones de muestra de plasma sanguíneo (debido a que no se utilizó ningún agente anticoagulante), 1-10 y 1-100. Se seleccionó la muestra con dilución 1-10 para cargar en el gel. Los resultados se muestran en la figura 1, donde el carril correspondiente a la muestra está marcado como “3”. Según Brandan (2008), el método más común para analizar las proteínas plasmáticas es la electroforesis, (la migración de proteínas por acción de un campo eléctrico), existen diversos tipos de esta y cada una usa un medio de soporte diferente. Su uso permite, después de teñir, la resolución de 5 bandas de proteínas plasmáticas. Designadas albúminas, α1, α2, β y γ. Estas últimas 4 son globulinas. Proteínas plasmáticas mayoritarias: ● Albúmina (60%): contribuyente mayoritario a la presión oncótica; transporte de lípidos y hormonas esteroideas. ● Globulinas (35%): transporte de iones, hormonas, lípidos; función inmune. ● Fibrinógeno (4%): componente esencial del mecanismo de coagulación (conversión a fibrina insoluble). ● Proteínas reguladoras (< 1%). A continuación en la tabla 3 se muestran las proteínas contenidas en la sangre, así como su peso molecular: Tabla 4. Proteínas contenidas en la sangre

Debido a que existe una gran cantidad de proteínas en la sangre, es posible que los resultados de la figura 2 muestren la expresión de la mayoría de éstas dentro del intervalo medido, siendo que proteínas como α-1-antitripsina, Haptoglobina, Eritropoyetina, Hemopexina, Inmunoglubulinas y especialmente la Prealbúmina tienen pesos que coinciden relativamente con los obtenidos en las bandas de la muestra en ambos ajustes. El plasma sanguíneo: Comprende el 55% del volumen sanguíneo total, presenta un pH ligeramente alcalino (7.3 a 7.4). Está constituido por sustancias orgánicas e inorgánicas. Sustancias inorgánicas: ● Agua. La sangre contiene 90% de agua. ● Sales minerales o electrolitos. Sustancias orgánicas: ● Proteínas plasmáticas. Son de tres tipos: fibrinógeno, seroalbúminas y seroglobulinas. Estas proteínas intervienen manteniendo la presión osmótica y oncótica del plasma, proporcionan la viscosidad de la sangre y participan en la regulación del equilibrio ácido básico de la misma; en la defensa inmunológica del organismo (globulinas) y en la coagulación sanguínea (fibrinógeno). ● Sustancias nutritivas. Productos finales del metabolismo. ● Gases. O, CO2 y N, se encuentran disueltos en el plasma. ● Hormonas y anticuerpos. ● Productos del metabolismo proteínico.

Conclusiones: ● Se realizó la técnica electroforesis SDS-PAGE, obteniendo una separación de proteínas de una muestra de sangre obteniendo bandas representativas con valores de peso molecular de 36.82kDa, 51.97kDa, 63.61kDa, 74.24kDa, 83.61kDa, 88.73kDa y 152.569kDa, correspondientes a los valores reportados de Eritropoyetina, α-1-antitripsina, Prealbúmina, Protombrina, Transferrina, inactivadores de la estearasas C1 y Haptoglobina. ● Se considera que el buffer de carga presentó inconvenientes debido a sus propiedades al momento de la corrida electroforética, siendo una de sus respuestas el desvanecimiento de las bandas de todas las muestras.

Cuestionario: 1.- ¿Qué resultados arrojaría un gel si las muestras no se prepararon con SDS? La función del SDS es la desnaturalización, al unirse a las proteínas da lugar a una linearización y a una uniformidad de la carga negativa de esta ocasionando que las proteínas se separan de acuerdo a su tamaño e independientemente de su carga, cuando no se hace un tratamiento previo con SDS las proteínas se separan en función de su carga/masa y esto se conoce como Nativa-PAGE, una banda nativa puede dividirse en varias en SDS, si la proteína tiene varias subunidades de distinto peso molecular, o bien en una banda de menor peso molecular, si las subunidades poseen el mismo peso molecular como se puede observar en la imagen 4.

Imagen 4. Comparación de bandas obtenidas a través de Nativa-PAGE y SDS-PAGE

2.- ¿Qué otros métodos se pueden utilizar para separar y/o purificar proteínas? Existen diferentes métodos basados en el tamaño, solubilidad, carga, adsorción y afinidad de las proteínas a continuación se enuncian algunos de acuerdo a estas carácteristicas: Tamaño.- Para la purificación de las proteínas de acuerdo a su tamaño están la electroforesis en gel, cromatografía de exclusión molecular y la ultracentrifugación. Solubilidad.- Precipitación con sales mejor conocido precipitación con solventes orgánicos y por su pH.

como

“Salting-out”,

Polaridad.- Se pueden realizar distintos tipos de cromatografías como de absorción, en papel, en fase reversa y de interacción hidrofóbica.

Carga.- Se encuentra la cromatografía de intercambio iónico, electroforesis e isoelectroenfoque. 3.- ¿Qué métodos se utilizan para detección de proteínas en geles de poliacrilamida? Descríbelos Para la detección de proteínas se usan colorantes o sustancias fluorescentes que se unen a las proteínas como por ejemplo el nitrato de plata que tiene la característica de producir una coloración caramelo y tiene una detección de concentración pequeña entre 2 a 5 ng. esta tinción se utiliza solamente para detección cualitativa. El azul de coomassie es el más aceptado para el revelado de geles de electroforesis y puede emplearse cuando las proteínas son abundantes. Algunos otros colorantes son el violeta de genciana, Azure A y Azul Índigo 23. 4.-¿Para qué se utiliza el β-mercaptoetanol en el buffer de carga de proteínas? Es un agente reductor que evita la oxidación de cisteínas y completan la linearización de la proteína al romper los puentes disulfuros. Referencias: Carrillo, J., Candia, M., Lugo, R., Espinoza, O., Noriega, J. (2013). Evaluación de procedimientos de Tinción para el Análisis de Proteínas por Electroforesis (SDS-PAGE). INVURNUS “En busca del conocimiento”. Vol 8 No. 1 19:26. Cardos, M., Lupano, C., Añon, M. (2000). Caracterización proteica y calidad panadera de diferentes pasajes de molienda de trigos argentinos. Información Tecnologica. Vol 11 No. 6. 53:64. Cultek. (2006). Soluciones electroforesis: Protocolos y Técnicas. Recuperado el 28 de Noviembre de 2016 en www.cultek.com Brandan, N. (2008). Proteínas Plasmáticas. 25/11/2016, de Universidad Nacional del Nordeste Sitio web: http://www.uaz.edu.mx/histo/Biologia/FaiUnneAr/Pdf/proteinas.pdf García,H. (2000). Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos, actualidad e importancia. 28/11/2016, de UNIV DIAG Sitio web: http://bvs.sld.cu/revistas/uni/vol1_2_00/uni07200.pdf

Roca, P., Oliver, J., & Rodríguez,, A. M. (2004) Bioquímica: técnicas y métodos. 1° Edición, Editorial Hélice: España. Pág. 221....