Reporte práctica 8. Microbiología de pescados y mariscos PDF

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Practicas de aseguramiento de alimentos de origen animal...

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Reporte práctica 8. Microbiología de pescados y mariscos. 

Introducción

Los hábitos alimenticios de los peces, la zona geográfica, la estación, la temperatura del agua, el tipo de pez, el lugar donde los pescados son capturados y las condiciones de almacenamiento, que incluyen la temperatura y la composición de la atmósfera del envase, determinan la presencia de los microorganismos específicos de la alteración. El principal signo de deterioro es el mal olor que se percibe al examinar las agallas, pues la región branquial es la más susceptible a la alteración microbiana. Los mejores indicadores de la alteración del pescado son la pérdida del brillo de los los ojos y los colores superficiales, cambios en el olor y presencia del limo superficial. Si el pescado no es eviscerado de inmediato, algunos organismos atraviesan las paredes del intestino y llegan a los tejidos internos de la cavidad abdominal. La evisceración y el fileteado pueden extender la microbiota intestinal sobre toda la superficie. Photobacterium sp, Shewanella putrefaciens, Brochothrix thermosphacta, Pseudomonas spp, Aeromonas spp y bacterias lácticas son miembros de microbiota de los pescados de agua templada. Sin embargo, S. putrefaciens es el organismo especifico del deterioro de los pescados y mariscos de agua fría marina almacenados sobre hielo, produciendo trimetilamina y sulfuro de hidrógeno. Por otra parte, Photobacterium sp. Causa la alteración bajo condiciones de atmósfera modificada. Pseudomonas spp y Shewanella spp son los agentes específicos del deterioro de pescados de agua mar templada, mantenidos en hielo. Pseudomonas fluorescens y P. lundensis son las especies predominantes mientras que P. fragi y P. putida son detectadas con menos frecuencia. La temperatura de almacenamiento y la composición de la atmósfera afecta la proporción de las especies mencionadas en la población final del pescado. Listeria monocytogenes está presente en el 7 a 18% de los productos pesqueros. Otros géneros, en su mayoría psicrotrofos, que suelen ser aislados de los productos de mar son Achromobacter, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Flavobacterium, Micrococcus, Moraxella, Proteus, Serratia, Sarcina y Vibrio. También suelen encontrarse especies de Mycobacterium en el pescado congelado 

Competencias

El alumno será capaz de tomar muestras de pescado y prepararlas para realizar los métodos de cuenta en placa de bacterias aerobias, microorganismos coliformes, hongos y levaduras y determinación de E.coli, utilizando métodos modernos (SIMPLATE) de microbiología de alimentos.

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Metodología

Preparación de la muestra El alumno asignado para la toma de muestra y su preparación se colocará guantes. Se realizarán cortes a diferentes trozos de pescado colocados en una charola sin alejarse del mechero y con las pinzas y tijeras previamente flameadas con alcohol al 70 %. La muestra a preparar será de aproximadamente 5 g. Se colocarán los pedacitos de pescado en el mortero y se procede a macerar la muestra adicionando 45 ml de agua peptonada. Una vez macerado, dejar reposar para colectar el líquido sobrenadante. Tomar 1 ml del sobrenadante para realizar 4 diluciones décuples. Estas se realizarán bajo estrictas condiciones de esterilidad. Se recomienda el uso de perilla. Homogenizar cada tubo de dilución antes de proceder a realizar la siguiente dilución. Para realizar los conteos microbiológicos se considerarán únicamente las últimas 2 diluciones. (103 y 104 ). Para la preparación de la cuenta de bacterias: Hidratar el medio de cultivo en 9.0ml de agua peptonada. Transferir 1.0 ml de la dilución correspondiente al frasco que contiene el medio. El volumen final dentro del frasco debe de ser de 10ml ± 0.2ml. agitar para disolver el medio totalmente. Es decir, se agregara 1ml de la dilución 104 al medio de cultivo SIMPLATE para bacterias aerobias (color -------------) SIMPLATE para hongos y levaduras (color -------- ---) SIMPLATE para coliformes y E. coli . (color --------- -) Y homogenizar perfectamente hasta suspender el medio . Se agregara 1ml de la dilución 103 al medio de cultivo SIMPLATE para bacterias aerobias (color --------------) SIMPLATE para hongos y levaduras (color -------------) SIMPLATE para coliformes y E. coli . (color -----------) Y homogenizar perfectamente hasta suspender el medio. Retirar la tapa de la placa SIMPLATE y vaciar la solución medio/muestra en el centro de la placa. Cerrar la placa. Sobre una superficie plana agitar suavemente en círculos con el fin de distribuir la mezcla del medio y la muestra en todos los pocillos. El plato puede ser tomado con las dos manos para inclinarlo ligeramente y así ayudar a

distribuir el líquido en los pocillos. Si es necesario, golpear suavemente sobre la mesa para eliminar las burbujas de aire que se hayan quedado en los pocillos. No preocupase si algunos pocillos están parcialmente llenos. Los pocillos que estén parcialmente llenos del líquido serán positivos si hay presencia de bacterias viables. Evitar el uso excesivo de fuerza al golpear para evitar que el líquido entre en contacto con la tapa. Presionando ligeramente la tapa contra el plato en cualquier lado de la cavidad de la esponja vaciar el exceso de medio. Inclinar el plato hacia usted para permitir que la esponja absorba el líquido. Observe el color base de los pocillos. Este color base es la mezcla de medio y muestra dentro de los pocillos. Invierta el dispositivo SIMPLATE. Incubar de 24 a 48 horas a 37°C± 1°C. Siembra de placas PETRIFILM Transferir 1.0 ml de la dilución correspondiente a la placa PETRIFILM para S. aureus, iniciando con la dilución más alta. Cuidar que sea depositado suavemente con la pipeta en posición perpendicular y en el centro de la placa. Aplicar ligera presión con el aplicador correspondiente, suavemente una vez depositada la dilución. Incubar por 24 - 48 hrs y realizar el conteo conforme a la guía de interpretación. Siembra de la Prueba 1, 2 de Salmonella Inocular el tubo de caldo glucosado con el sobrenadante restante del mortero. Incubar por 24 hrs a 37°C. Tomar 3 asadas del cultivo e inocular la prueba 1,2 en su extremo de tapón de rosca negro de baquelita y agregar 2 gotas de reactivo de yodo. En el otro extremo, de tapón blanco, agregar una gota del antisuero específico para Salmonella y recortar con tijeras flameadas la punta interna del tapón. Incubar por 24 hrs. Resultados e interpretación: Observar si hubo crecimiento y la formación de líneas de precipitación. Identificación de bacterias por el sistema de Microscan Del macerado original hecho con la muestra de mariscos, sembrar por estría cruzada en una caja de Petri con agar TCBS adicionado con 2% de sal, e incubar por 24-48 hrs. De 30 a 32 °C. Sembrar por estría cruzada una colonia aislada en el agar TCBS en agar TSA (al 2% de sal) e incubar de 18 a 24 hrs. De 30 a 32°C Realizar tinción de Gram (para seleccionar el panel a inocular adecuado). Con el asa tomar 3 o 4 colonias aisladas, cuidando de no perforar o rayar el agar y hacer una suspensión bacteriana en un tubo con 3 ml de SSF. Abrir un frasco del diluyente y vaciarlo en la charola acanalada. Fijar la micropipeta múltiple a la tapa. Llevar a cabo la extracción del diluyente y vaciarlo en la placa de identificación MicroScan. Adicionar con pipeta estéril una gota de la suspensión bacteriana en cada uno de los pozos de pruebas bioquímicas de la placa de identificación de MicroScan. En la placa inoculada existen algunos pocillos cuyos nombres se encuentran subrayados, a los cuales se les adicionaran tres gotas de aceite mineral a cada uno colocar una tapadera e incubar de 30 a 32 °C p or 24 hrs. Para

realizar la lectura, es necesario adicionar algunos reactivos en pocillos específicos, indicados en la tabla de interpretación Para gram negativos Adicionar al pozo IND 3 gotas de reactivo de Kovacs Adicionar al pozo VP 1 gota de KOH y 1 gota de alfa-naftol Adicionar al pozo TDA 1 gota de Cloruro férrico Adicionar al pozo NIT 1 gota de ácido sulfanilico y 1 gota de N,Ndimetil Realizar la prueba de oxidasa a la bacteria en una tira reactiva Para gram positivos Adicionar al pozo NIT 1 gota de ácido sulfanilico y 1 gota de N,Ndimetil Adicionar al pozo VP 1 gota de KOH y 1 gota de alfa-naftol Adicionar al pozo PYR 2 gotas de peptidasa Comprobar la hemólisis de la bacteria Ingresar la información de los pozos positivos en el sistema LabPro para microscan para la obtención de al menos el género bacteriano. 

Resultados

Fig.1 siembra de estafilococcus

-3

-4

Fig.2 hongos y levaduras

-3

-4

Fig.3 coliformes totales

-4

-3

Fig.4 B. aerobias

Fig.5 Microescan Fig.6 Prueba 1,2 Salmonella

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Discusión

Según Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez (2009). Posteriormente a la toma de muestra y como parte del análisis, se hace una dilución primaria cuya finalidad es lograr obtener una muestra representativa del alimento, esto es, tanto en el aspecto cualitativo (diferentes tipos de bacterias) como en el cuantitativo, y así lograr una distribución lo más uniforme posible, de los microorganismos contenidos en la muestra destinada al análisis. Con este fin, se utiliza un diluyente que favorezca la recuperación de los microorganismos presentes, para ponerlos de manifiesto cuando se cultiven; para lograrlo, el diluyente debe tener la osmolaridad y el pH favorables para iniciar la recuperación y actividad de las células microbianas presentes, así como para favorecer aquellas que se buscan entre una población mixta. Se concuerda con el autor ya que buscamos aislar colonias bacterianas para poder diagnosticar el agente causalSe pretende encontrar el número de microorganismos por unidad de volumen, hasta asegurar que después de la incubación se obtenga un resultado cuantificable, esto se logra después de realizar tantas diluciones decimales seriadas como sea necesario, en el mismo diluyente. Este resultado puede ser la cuenta de colonias en placas o la observación de resultados proporcionales al tamaño de la población, en el caso de tubos o matrace estas diluciones se hacen para que la cantidad de bacterias se pueda cuantificar por eso se tomaron las diluciones -3 y -4 por lo que se concuerda con el autor ya que se realizaron las diluciones necesarias poder cuantificar las bacterias. Los microorganismos están ampliamente distribuidos en la naturaleza, por lo que siempre se encuentran presentes en diversos productos, especialmente en aquellos que favorecen de algún modo su sobrevivencia o desarrollo según el autor Mossel DAA (2003) dice que la microbiología del pescado marisco depende del lugar donde fue capturado ya sea en aguas limpias o en aguas contaminadas por lo que depende del lugar donde fue capturado, también dice el autor Mossel DAA (2003) que depende del manejo de las personas que manejen el pesado o el marisco, ya sea sin ninguna sanitización o por la contaminación entre los mismos animales que no se separan según su especie y microbiología bacteriana. Brown H. (2003) dice que los alimentos por su producción primaria, generalmente tienen una importante microbiota “normal”, según la región y condiciones en que se producen; además, su composición tiende a conservar dicha flora y, por supuesto, le proporciona nutrientes de manera que, si las condiciones lo permiten, los microorganismos pueden multiplicarse en los alimentos. Como consecuencia de este desarrollo microbiano, los alimentos pueden deteriorarse y perder sus atributos por esto se concuerda con el autor Brown H. (2003) ya que el pescado no tuvo un buen manejo, ya sea de higiene o refrigeración lo que causo su descomposición

Swanson K.M., Petran R.L., Hanlin J.H. (2001) Además de la microbiota normal, los alimentos son susceptibles de contaminación durante su manejo, ya sea por operadores, equipo, fauna nociva, o por contaminación cruzada; algunos de los microorganismos contaminantes pueden ser patógenos y en tal caso, su desarrollo e incluso su mera sobrevivencia, pueden ocasionar desde el incumplimiento de normas de higiene y seguridad, hasta la aparición de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA’s) se concuerda con el autor ya que este caso fue por contaminación durante el manejo y por contaminación cruzada. Según los autores Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. (2009)En el microscan no se detectó ninguna bacteria por lo que pudo ser una bacteria de humanos por la que no salió en el scan, por lo que termina de confirmar que fue una contaminación por un mal manejo de la persona que estaba manejando el producto, este scan cuenta con un gran número de bacterias en la base de datos en algunos casos salen bacterias que son compatibles en animales y humanos por lo que se puede leer pero en este caso no se dio el resultado de ninguna por lo que no es una bacteria común en los animales. 

Conclusión

En esta práctica se cumplió con el objetivo ya que se pudo observar una contaminación bacteriana en el pescado, ya que pudo ser causado por un mal manejo o por una contaminación cruzada ya que en la muestra había camarón, lobina, pulpo por lo que se pudo contaminar, ya que cada animal tienen diferentes microorganismos, esto es de suma importancia para la carrera de medicina veterinaria ya que si nosotros prevenimos estas contaminaciones con unas buenas prácticas de manejo podemos evitar muchas enfermedades (ETA`s) y ayudar a la salud pública. 

Bibliografía

Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. (2009). Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México. Mossel DAA (2003). Microbiología de los Alimentos. 2ª ed. Acribia, Zaragoza, p 15, 599, 634, 637. Brown H. (2003) “BacteriologicalAnalytical Manual”. 9th ed. Arlington, VA: AOAC. Swanson K.M., Petran R.L., Hanlin J.H. (2001) “Culture MethodsforEnumeration of Microorganisms”. In: Compendium of MethodsfortheMicrobiologicalExamination of Foods. 4th ed. Downs F.P. &Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 53-67.

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Asignaciones.

INVESTIGAR LOSMICROORGANISMOS PATOGENOS QUE PUEDEN ENCONTRARSE EN EL PESCADO Y LOS MARISCOS. Las bacterias productoras de aminas vasopresoras (escombrotoxina), como histidina y otras, son en su mayor parte enterobacterias mesófilas, entre ellas Proteus morganii, Hafnia alvei y Klebsiella pneumoniae. La conservación del pescado a 0ºC impide la formación de estos compuestos. Clostridium botulinum tipo E puede crecer y sintetizar toxinas a 3ºC y la prevalencia en pescado crudo varía de 10 a 40% según las especies y en los productos envasados al vacío es 5%, por lo que constituye un riesgo en la industria pesquera. Vibrio parahaemolyticus, V. cholerae y V. vulnificus son las principales especies de vibrios causantes de las infecciones relacionadas a los pescados y mariscos. También se suelen aislar Salmonella y Shigella aunque no sean contaminantes normales del pez. Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista que puede iniciar algunas infecciones en personas con las defensas bajas y las cepas patógenas tienen una alta resistencia a los antibióticos debido a un plásmido. Las especies de Aeromonas son patógenos para peces pero A. hydrophila y A. sobria son enterotoxigénicas para el hombre. Los patógenos humanos son retenidos por las ostras sin o con mínima inactivación. Como la velocidad de depuración es muy baja pueden representar un peligro para la salud pública si son criadas en aguas contaminadas. Las ostras suelen transmitir ooquistes de Cryptosporidium parvum, quistes de Giardia lamblia, esporos de microsporidios Encephalitozoon spp. El pescado alberga numerosos parásitos que, en su mayoría, no suelen afectar al hombre. Sin embargo, Anisakis es un nemátodo que se encuentra en la musculatura de los peces y sobrevive a la congelación. Se ingiere con el pescado crudo, adobado o ahumado en frío, o poco cocinado. Otros parásitos son las tenias Diphyllobothrium latum, en el hemisferio norte, y D. pacificum, en América del Sur, que son transmitidas al hombre por el pescado crudo. La intoxicación paralizante es causada por mejillones, ostras, berberechos y almejas que han incorporado a su organismo algas tóxicas. Aparece a la media hora después de la ingestión, causando síntomas neurológicos que en el 20% de los casos conducen

a la muerte. Las saxitoxinas son producidas por especies de Gonyaulax, Gymnodinium y Pyrodinium. INVESTIGAR LOS TIPOS DE CONSERVACION DEL PESCADO Y MARISCOS. Enhielado Para la conservación del pescado fresco, desde que se pesca hasta su exhibición y consumo, una vez extraído o capturado, el pescado debe ser acondicionado en las bodegas de los barcos pesqueros con hielo molido o hielo en escamas. Esta hace que el pescado se enfríe, pero no se congele. Una vez en tierra, se los dispone en cajones o en envases, distribuyendo el hielo por debajo y por encima. Cuando el pescado llega a la pescadería se lo almacena en cámaras de frío, pero sin congelarlo. Luego se lo exhibe en las góndolas de los comercios, también acondicionados con hielo en escamas o molido. Luego el consumidor debe conservarlo en el refrigerador hasta prepararlo en la cocina, sabiendo que el tiempo de conservación en fresco es limitado. Congelación La industria de la alimentación ha desarrollado cada vez más las técnicas de congelación para una gran variedad de alimentos: frutas, verduras, carnes, pescados y alimentos El fundamento de la congelación es someter a los alimentos a temperaturas iguales o inferiores a las necesarias de mantenimiento, para congelar la mayor parte posible del agua que contienen. Prácticamente no se pierden vitaminas ni minerales debido a que la congelación no afecta ni a las proteínas, ni a las vitaminas A y D, ni a los minerales que ellos contienen. Conservas de pescado Se conocen corrientemente como pescados enlatados y son pescados envasados en recipientes herméticamente cerrados, sometidos a un tratamiento térmico suficiente para proteger su conservación y seguridad durante un almacenamiento prolongado a temperatura ambiente. Este método de conservación se aplica por lo general a pescados grasos (especialmente sardinas y túnidos) y mariscos (principalmente mejillones, berberechos, navajas y cefalópodos). El pescado fresco es muy nutritivo, pero la conserva de pescado también. El proceso industrial no altera la composición nutricional del alimento, por lo que mantiene todas sus vitaminas y minerales intactos. Al no darle la luz al contenido de la lata, los nutrientes fotosensibles (vitaminas A, K y ácidos fólicos) no se pierden con el paso del tiempo. Salazón

Es una de las técnicas más antiguas de conservación de los alimentos. La sal aumenta la vida útil de los productos de la pesca retrasando su alteración. La sal se utiliza conjuntamente con la desecación (caso del bacalao seco), con el humo (ahumados) o con el vinagre (encurtidos), para mejorar la conservación del pescado y conseguir las características particulares de los pescados desecadossalados, ahumados y escabechados, respectivamente. Ahumado En este caso, después de salado, se somete el pescado a la acción del humo de madera no resinosa. Como consecuencia de la interacción de la sal con los componentes del humo se modifican el color, olor y sabor del pescado al tiempo que se produce una deshidratación parcial de los tejidos del pez y se modifica su textura. La deshidratación parcial de los tejidos y la presencia en el humo de compuestos con actividad antimicrobiana o bacteriostática determinan un ligero aumento de la vida útil del pescado ahumado, respecto del fresco, pero insuficiente para permitir su conservación a temperatura ambiente, por lo que estos productos se deben conservar en refrigeración. Ejemplos típicos de este tipo de productos son el salmón, la trucha y la palometa ahumadas. Escabechado Consiste en la conservación del pescado por la acción conjunta de la sal y el vinagre. La creación de un medio ácido y la disminución del agua disponible consiguen aumentar la vida útil del pescado. Los boquerones en vinagre rep...