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Cromatografía Liquida

Cromatografía de líquidos de alta eficacia La cromatografía de líquidos es importante porque la mayoría de los compuestos no son suficientemente volátiles para que se les pueda aplicar la cromatografía de gases. La cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) utiliza una presión elevada para forzar al disolvente a que pase por una columna que contiene partículas muy finas, consiguiendo así separaciones de gran resolución. El equipo de HPLC consta de un sistema de suministro de disolvente, una válvula de inyección de muestra, una columna de alta presión, un detector y un ordenador para controlar el equipo y visualizar los resultados. Actualmente muchos equipos incluyen además un horno para controlar la temperatura de la columna.

EL PROCESO CROMATOGRÁFICO _Las partículas pequeñas aseguran mayor eficacia, pero requieren mayor presión La eficacia de una columna empaquetada aumenta al disminuir el tamaño de las partículas de la fase estacionaria. El tamaño típico de las partículas en HPLC es de 3-10 µm. En condiciones óptimas, el número de platos teóricos de una columna de longitud L (cm) es:

donde dp es el diámetro de las partículas en micrómetros. Cuanto más pequeñas son las partículas, mayor es el número de platos. Una razón por la cual las partículas pequeñas originan mejor resolución es que permiten un flujo más uniforme a través de la columna, reduciendo así el término de camino múltiple (A) de la ecuación de van Deemter. Otra razón es que el camino que debe recorrer el soluto en su difusión en la fase móvil que hay entre las partículas es del orden del tamaño de las partículas. Cuanto más pequeñas son las partículas, menor es la distancia en la que debe difundirse el soluto en la fase móvil. Este efecto disminuye el término C de la ecuación de van Deemter, correspondiente al tiempo finito de difusión. El caudal óptimo para partículas pequeñas es mayor que para partículas mayores, porque los solutos se difunden a través de distancias menores. La desventaja que tienen las partículas pequeñas es la resistencia que ofrecen al flujo del disolvente. La cromatografía analítica de alta eficacia precisa presiones de 7–40 MPa (70–400 bar) para alcanzar caudales de 0,5–5 mL/min. Las partículas más pequeñas dan mejor resolución, y tiempos de elución más cortos. 1

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El comportamiento real de partículas de 1,0 µm, con una bomba de alta presión adecuada, proporciona la eficacia predicha.

_La columna El equipo HPLC utiliza columnas de acero o de plástico de una longitud de 5–30 cm y un diámetro interior de 1–5 mm. Las columnas son caras y se degradan con facilidad por el polvo, o las partículas de las muestras o del disolvente. Por eso, se protege la entrada de la columna con una columna corta, la precolumna, que contiene la misma fase estacionaria que la columna analítica. Las partículas finas y solutos que se adsorben con fuerza quedan retenidos en la precolumna, que hay que remplazar periódicamente. Calentando una columna cromatográfica, de ordinario, disminuye la viscosidad del disolvente reduciéndose así la presión requerida o permitiendo un mayor caudal. Al aumentar la temperatura se acortan los tiempos de retención, y mejora la resolución, porque aumenta la velocidad de difusión de los solutos. Sin embargo, aumentando la temperatura se puede degradar la fase estacionaria y reducir la vida de la columna. Si no se controla la temperatura de la columna, ésta podría fluctuar con la temperatura ambiente. Usando un horno a una temperatura a pocos grados por encima de la temperatura ambiente se mejora la reproducibilidad de los tiempos de retención, y la precisión del análisis cuantitativo.

_La fase estacionaria El soporte más común en HPLC son partículas microporosas esféricas de sílice muy pura, que son permeables al disolvente, y que tienen un área superficial de varios centenares de metros cuadrados por gramo. La sílice, por lo normal, se disuelve en agua a pH superior a 8, por lo que no puede utilizarse por encima de ese pH. Algunas calidades de sílice son estables hasta pH 9 ó 10. Para analizar por cromatografía compuestos básicos a pH entre 8 y 12, se pueden usar soportes poliméricos, como el poliestireno. La fase estacionaria está unida covalentemente al polímero.

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La superficie de la sílice tiene hasta 8 µmoles de grupos silanol (Si-OH) por metro cuadrado. Todos los grupos silanol están prácticamente protonados si el pH es 2-3. Se disocian formando Si-O - en un amplio intervalo de pH por encima de 3. Los grupos Si-O - superficiales retienen con fuerza las bases protonadas y originan colas. La sílice pura se puede utilizar como fase estacionaria en cromatografía de adsorción. Más concretamente, en la cromatografía de reparto líquido-líquido, que se lleva a cabo con fase estacionaria enlazada covalentemente a la sílice, mediante reacciones tales como:

Hay 4 µmol de grupos R por metro cuadrado de soporte, con muy poca pérdida de fase estacionaria de la columna durante una cromatografía. Para separar isómeros ópticos, existen en el comercio muchos grupos R ópticamente activos. El enlace siloxano (Si-O-SiR) se hidroliza por debajo de pH 2, de modo que la HPLC con una fase enlazada en soporte de sílice está limitada al intervalo de pH 2-8. Si los átomos de silicio se enlazan con grupos voluminosos isobutilo, el enlace Si-O-Si se hace menos accesible al ataque de H3O+ y la fase estacionaria es estable a pH bajos durante largos periodos, incluso a temperaturas elevadas (p. ej. a pH 0,9 a 90 °C). Otro ejemplo de una clase distinta de fase estacionaria es carbón grafítico poroso depositado sobre sílice. Este material presenta una retención mayor para compuestos no polares en relación con la retención de fases enlazadas como C 18. También tiene una gran afinidad por compuestos polares, y consigue separaciones de compuestos isoméricos que no se pueden hacer con columnas C18. La fase estacionaria es estable en el intervalo de pH desde ácidos 10 M hasta base 10 M.

_El proceso de elución En cromatografía de adsorción el disolvente compite con las moléculas del soluto por ocupar los puntos activos de la fase estacionaria. La diferente capacidad de los distintos disolventes para eluir un determinado soluto del adsorbente es prácticamente independiente de la

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naturaleza del soluto. Se puede describir la elución como el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente. La serie eluotrópica es la ordenación de los disolventes según su capacidad relativa para desplazar solutos de un determinado adsorbente. La fuerza eluyente (ε°) es una medida de la energía de adsorción del disolvente, supuesto el valor cero para el pentano en relación con sílice pura. Cuanto más polar es el disolvente, mayor es su fuerza eluyente respecto a la sílice, en cromatografía de adsorción. Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente, tanto más rápidamente se eluirán los solutos de la columna. La cromatografía de adsorción sobre sílice pura es un ejemplo de cromatografía de fase normal, que se caracteriza por usar una fase estacionara polar y un eluyente menos polar. Un disolvente más polar tiene fuerza eluyente mayor. La cromatografía de fase inversa, que es la más utilizada, se caracteriza porque la fase estacionaria es no polar o débilmente polar y el disolvente es más polar. Un disolvente menos polar tiene mayor fuerza eluyente. Los picos en cromatografía de fase inversa no suelen presentar colas, porque la fase estacionaria tiene pocos puntos que adsorban con tanta fuerza a algún soluto, originando colas. La cromatografía de fase inversa también es menos sensible a impurezas polares (como el agua) que pueda haber en el eluyente.

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_Elución isocrática y en gradiente La elución isocrática se lleva a cabo con un único disolvente (o una mezcla de disolventes de composición fija). Si un disolvente no permite una elución suficientemente rápida de todos los componentes, se puede usar una elución en gradiente. En este caso, se van añadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A, produciendo así un gradiente continuo. En una separación de fase inversa, la fuerza eluyente disminuye a medida que el disolvente se hace más polar.

_Selección del modo de separación Existen varios modos de separar los componentes de una mezcla dada. Si la masa molecular del analito es menor que 2000, hay que usar la parte superior de la figura; si la masa molecular es mayor que 2000, la parte inferior. La cromatografía de interacción hidrófoba está basada en la interacción de una fase estacionaria con la región hidrófoba de un soluto, como por ejemplo de una proteína. Las

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sustancias hidrófobas repelen el agua; el agua no las moja. Las sustancias hidrófilas son solubles en agua, o tienden a captar agua en su superficie. Una proteína puede tener partes hidrófilas por las que se solubiliza en agua, y partes hidrófobas capaces de interaccionar con una fase estacionaria hidrófoba.

_Disolventes En HPLC se necesitan disolventes muy puros y caros, de calidad HPLC, para evitar que se degraden por impurezas las columnas, que son caras, y para minimizar el ruido de fondo de las señales del detector debido a los contaminantes. Se pone un filtro en la salida del depósito del disolvente, para impedir el paso de partículas micrométricas. La muestra y el disolvente se pasan a través de una precolumna corta y desechable, que contiene la misma fase estacionaria que la columna analítica, y que fija las especies que se adsorberían fuertemente en la columna. Aun cuando se use una precolumna, está recomendado lavar la columna analítica periódicamente, para 6

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prolongar su vida. Los disolventes se deben purgar previamente, burbujeando He a través de ellos, o aplicando vacío, para eliminar el aire disuelto. Las burbujas de aire crean dificultades en las bombas, en las columnas, y en los detectores. El oxígeno disuelto absorbe radiación UV en el intervalo de longitudes de onda de 200 a 250 nm, interfiriendo en la detección en el UV. Las separaciones de fase normal son muy sensibles a la presencia de agua en el disolvente. Para acelerar el equilibrio de la fase estacionaria con el cambio de eluyente, los disolventes orgánicos usados en cromatografía de fase normal tienen que estar saturados en un 50% con agua. Esto se puede conseguir agitando el disolvente anhidro con unos pocos mililitros de agua; luego se separa el disolvente saturado del exceso de agua y se le añade una cantidad igual de disolvente anhidro. Cuando se trabaja con elución en gradiente en separaciones de fase inversa, después de cada análisis se debe pasar por la columna un volumen de disolvente igual a 10-20 volúmenes de columna vacía, para acondicionar la fase estacionaria con el disolvente antes del siguiente análisis. El reequilibrado puede durar tanto como una separación. Añadiendo un 3% en volumen de 1propanol al disolvente (de forma que haya siempre un 3% de 1-propanol en cualquier punto del gradiente) permite reducir el volumen necesario para alcanzar el equilibrio a 1,5 veces el volumen de la columna vacía.11 Se cree que el propanol cubre la fase estacionaria con una monocapa de alcohol, que no varía mucho durante toda una separación.

INYECCIÓN Y DETECCIÓN EN HPLC _Bombas y válvulas de inyección La calidad de una bomba en HPLC se mide atendiendo a si produce un flujo constante y reproducible. Un caudal fluctuante da origen a ruido en el detector, que no deja ver bien las señales débiles. Se forman gradientes hasta con cuatro disolventes, ajustando los volúmenes de los líquidos a través de una válvula de cuatro vías de baja presión, e impulsando la mezcla con la bomba a alta presión. El proceso de formación de gradiente se controla electrónicamente, y se puede programar con una precisión del 0,1% en volumen. La válvula de inyección, permite bucles intercambiables de carga de muestra, cada uno de un volumen fijo, que van desde 2 a 1000 mL. Se utiliza una jeringa, en la posición de «carga», para lavar y llenar el bucle con nueva muestra a la presión atmosférica. El líquido que procede de la bomba a alta presión pasa por el segmento de válvula situado en la parte inferior izquierda. Cuando la válvula gira 60° en sentido contrario a las agujas del reloj, el contenido del bucle de muestra es inyectado a alta presión en la columna.

_Detectores espectrofotométricos Un detector ideal debe ser sensible a pequeñas concentraciones de analito, dar una respuesta lineal y no ensanchar los picos del cromatograma. No debe ser sensible a variaciones de temperatura y de la composición de disolvente. Para evitar que se ensanchen los picos, el volumen 7

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del detector deber ser menor que el 20% del volumen de la banda cromatográfica. Las burbujas que puedan existir en el detector producen ruido, y por eso se debe aplicar al detector una contrapresión, para impedir que se formen burbujas durante la despresurización del eluyente. El detector más común en HPLC es el detector de ultravioleta, que utiliza una celda de flujo, porque muchos solutos absorben luz ultravioleta. Los equipos más simples utilizan la intensa raya de emisión a 254 nm de una lámpara de mercurio. Los instrumentos más versátiles tienen lámparas de deuterio, xenón o wolframio, y un monocromador, con el que se puede elegir la longitud de onda óptima, de ultravioleta o visible, para detectar los analitos estudiados. Los detectores de gran calidad tienen intervalos de escala completa desde 0,0005 a 3 unidades de absorbancia, que tienen con un nivel de ruido del 1% a fondo de escala. El intervalo lineal cubre más de cinco órdenes de magnitud de concentración de soluto (que es otra manera de decir el intervalo en que se cumple la ley de Beer). Los detectores de ultravioleta están indicados para elución en gradiente, y para disolventes que no absorben a la longitud de onda de trabajo. Los detectores de fluorescencia excitan el eluato con un láser, y miden la fluorescencia que se origina. Estos detectores son muy sensibles, pero responden sólo a analitos que presentan fluorescencia. Para aumentar la utilidad de los detectores de fluorescencia y los electroquímicos, se puede enlazar covalentemente al analito grupos fluorescentes o electroactivos. Este proceso de derivatización se puede llevar a cabo en la muestra antes de hacer la cromatografía, o añadiendo los reactivos al eluato entre la columna y el detector (llamada derivatización postcolumna).

_Detector de índice de refracción Un detector de índice de refracción responde a casi cualquier soluto, pero su límite de detección es aproximadamente 1000 veces peor que el de un detector de ultravioleta. El detector del tipo de deflexión tiene dos compartimientos triangulares de 5 a 10 mL, a través de uno pasa disolvente puro, y a través del otro eluato. Para eliminar la radiación infrarroja (que calentaría la muestra), se hace pasar luz visible colimada (paralela) a través de la celda, con disolvente puro en los dos compartimientos, y se dirige a la fotocélula mediante la placa de deflexión. Cuando a la celda entra un soluto de diferente índice de refracción, el haz se desvía, y la señal dada por la fotocélula varía. Los detectores de índice de refracción no sirven en elución en gradiente, porque es imposible ajustar exactamente la muestra y la referencia mientras varía la composición del disolvente. Los detectores de índice de refracción son sensibles a las variaciones de presión y temperatura (0,01 °C). Debido a su baja sensibilidad, los detectores de índice de refracción no sirven en análisis de trazas. Tienen intervalos pequeños de linealidad, que comprende concentraciones de soluto que varían sólo en un factor de 500. La principal ventaja de este detector es que es casi universal, y responde a todos los solutos, incluso a aquellos que absorben poco en el ultravioleta.

_Detector de dispersión de luz previa evaporación 8

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Un detector de dispersión de luz previa evaporación (del eluyente) responde a todos los solutos que son claramente menos volátiles que la fase móvil. El eluato entra en este detector por la parte superior. En el nebulizador, el eluato se mezcla con nitrógeno, y se le fuerza a pasar por un capilar, a cuya salida forma una fina dispersión de gotitas. El nebulizado se fuerza a pasar a través de un tubo caliente, donde se evapora el disolvente, dejando una nube de finas partículas sólidas, que entran en la zona de detección situada en el fondo del tubo. Las partículas se detectan por la luz que procede de un diodo láser y que llega al fotodiodo por dispersión. El detector de dispersión de luz previa evaporación responde a la masa del analito, no a su estructura o masa molecular. Si se observa un pico grande y uno pequeño, se puede estar seguro de que el pico pequeño corresponde a menos cantidad que la del pico grande. Con un detector de ultravioleta, una pequeña cantidad de un analito que absorbe mucho da una señal más intensa que una cantidad grande de un analito que absorbe poco. La respuesta de un detector de dispersión de luz no es lineal, de modo que frecuentemente se recurre a polinomios para construir la curva de calibrado. El detector de dispersión de luz es compatible con una elución en gradiente. Además, no hay picos asociados con el frente del disolvente, y así no se dan interferencias con los picos que se eluyen al principio. Si se usa un tampón en el eluyente, debe ser volátil, o de lo contrario se evaporaría formando partículas sólidas, que dispersarían la luz y no dejarían discernir la señal del analito. Se pueden usar tampones de baja concentración a partir de ácido acético, fórmico o trifluoacético, acetato de amonio, fosfato de diamonio, amoniaco o trietilamina.

_Detector electroquímico Un detector electroquímico responde a analitos que pueden oxidarse o reducirse, como fenoles, aminas aromáticas, peróxidos, mercaptanos, cetonas, aldehídos, nitrilos conjugados, compuestos halogenados o nitroaromáticos. Para solutos oxidables, son comunes los electrodos de cobre o de carbón vitrificado. Para solutos reducibles, un buen electrodo de trabajo puede ser el de gotas de mercurio. La corriente es proporcional a la concentración del soluto en un intervalo de seis órdenes de magnitud. Se tiene que trabajar con disoluciones acuosas o de disolventes polares que contengan electrolitos, y deben estar rigurosamente exentas de oxígeno. Los iones metálicos que puedan proceder de los tubos se deben enmascarar añadiendo EDTA al disolvente. Estos detectores son muy sensibles a las variaciones de caudal y de temperatura. Haciendo medidas electroquímicas mediante impulsos, con electrodos de trabajo de Au o Pt, se pueden detectar también alcoholes, hidratos de carbono y compuestos de azufre. El electrodo se mantiene a -0,8 V (respecto a un electrodo de calomelanos) durante 120 s, para que, mediante un proceso de oxidación, se desorban los posibles compuestos orgánicos adsorbidos, y se oxide la superficie metálica. A continuación, se lleva el electrodo a -0,6 V durante 200 ms, para reducir de nuevo el óxido al metal original. Se lleva entonces el electrodo al potencial constante de trabajo (el intervalo habitual es entre -0,4 y -0,4 V), al cual se oxida o se reduce el analito. Después de esperar 400 ms, para que se anule la corriente de carga se integra la corriente durante los 9

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siguientes 200 ms, para medir el analito. La secuencia de impulsos que acabamos de describir se repite para obtener nuevos datos a medida que el eluato sale de la columna. Mediante este procedimiento, el etilenglicol (OHCH2CH2OH), da una relación señal/ruido de 3, a una concentración de 10 ppb.

ELABORACIÓN DE UN MÉTODO DE SEPARACIONES DE FASE INVERSA La cromatografía de fase inversa es normalmente adecuada para separar mezclas de compuestos orgánicos neutros o cargados de baja masa molecular. Si no ...