Taller 11 Diseño de primers PDF

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Práctica de diseño de primers con PrimerBlast...

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TALLER DISEÑO DE PRIMERS 1. ¿Qué es un primer universal y un primer degenerado? (1,00) Los primers universales son primers de secuenciación que se unen a una secuencia determinada en muchos vectores de clonación plasmídicos para amplificar un gen similar, muchos de estos son derivados de vectores pUC. Estos primers son buenos sitios de PCR y secuenciación, ya que flanquean el sitio de clonación múltiple donde se colocaría una secuencia de ADN insertada(«Universal Primer List», s. f.). Los primers degenerados son definidos como una mezcla de secuencias de oligonucleótidos en la cuales algunas de sus posiciones tienen diferentes posibles bases, dando origen a cebadores con secuencias similares que cubren todas las posibles combinaciones de nucleótidos para una secuencia de proteína determinada (Iserte, 2013). Son ampliamente usados cuando solo se tiene la secuencia proteica del gen de interés(«Degenerate Primer Design», s. f.). 2. ¿Qué es la Tm? (1,00) La temperatura de melting de un oligonucleótido, o Tm, es una temperatura en la cual la mitad de los oligonucleótidos es duplicada con su complemento perfecto y la otra mitad se libera en solución(«Melting Temperatures of Oligonucleotides», s. f.). Los principales factores que afectan este valor son: concentración de sales, concentración de ADN, presencia de agentes desnaturalizantes (DMSO), secuencia, longitud y condiciones de hidridización. Tm es un parámetro crítico a considerar cuando se diseña algún experimento de biología molecular, incluyendo PCR(«The importance of melting temperature in molecular biology applications», 2008). a. ¿Para realizar un PCR cuál es la utilidad de conocer esta temperatura? Conociendo esta temperatura se garantiza un equilibrio entre las plantillas libres y los primers, de esta manera, la unión entre primers y plantillas se da mejor y la PCR se puede lograr de una manera más eficiente. Además a partir de la Tm se halla la Temperatura Annealing que determina el rendimiento de la amplificación en el PCR. b. ¿Cómo se calcula la Tm? La temperatura melting puede calcularse por medio de la regla de Wallace:

Tm= 2(A+T) + 4(G+C) A, T, G, C son el número de cada nucleótido en el primer. ("Tm de Oligonucleótidos", 2018).

Existen otras maneras de las que se puede calcular la Tm:

Se tiene en cuenta esta ecuación para luego reemplazarla en la anterior.

De esta manera:

Se despeja la temperatura y ya se tiene la ecuación.

3. Descargue la secuencia en formato FASTA de ERG11 de Candida albicans (ojo: baje solo la región codificante CDS). (1,5) a. Usando el programa primer3 o primer3 plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi‐ bin/primer3plus/primer3plus.cg), realice una pareja de primers que abarque los últimos 200 a 500pb y que no sea más grande de 400-500pb. Usando la página generadora de primers del ncbi, se obtiene el siguiente par de primers para todo Candida albicans:

b. Diga porque cree que su pareja de primers tiene unas buenas características. (Para responder tenga en cuenta y reporte la Tm, longitud de primer, porcentaje de GC, valores de ANY y SELF). En general se buscan valores bajos de cualquier tipo de complementariedad, además se buscan valores altos de porcentaje de GC y Temperaturas de melting parecidas entre los primers. Criterios recomendados:  %GC: 40-50  Self complementary: < 8.00 (Mientras más pequeño mejor)  Self 3’ complementary: < 3.00 (Mientras más pequeño mejor) Se puede observar en el reporte mostrado por Blast del cnbi que se cumplen los criterios necesarios, además que la longitud del producto obtenido (401) se encuentra entre el rango querido. c. Teniendo en cuanta lo explicado en clase porque es de particular interés la amplificación y secuenciación de estos últimos 400‐ 500pb en la secuencia de ERG11 de C. albicans. Para apoyar su respuesta busque un artículo CIENTÍFICO relacionado con el tema. En un estudio sobre la resistencia al azol, se amplificaron secuencias de ADN de diferentes cepas de Candida albica y se estudiaron mutaciones en regiones específicas, el estudio mostró varias mutaciones que proveen una resistencia al azol (Hai et al., 2013). Se realizó una amplificación de una región delimitada por los primers:  5′-ATTGGAGACGTGATGCTGCTCAA-3′  5′-CCAAATGATTTCTGCTGGTTCAGT-3′ Esto produce amplificaciones entre las regiones de 728bp y 1560bp, lo que da como resultado de PCR un fragmento con una longitud de 833bp. Debido a la posición de los primers se demuestra que dentro de los últimos 500bp del gen para EGR11 existen varias regiones de interés donde suelen existir mutaciones que resultan en una resistencia de C. Albica al azol; para suponer esto cabe recordar que el genoma de C. Albica para EGR11 es de 1580bp aproximadamente.

4. Haga un primer blast de las siguientes secuencias de primers (1,5) a. F´ CCCATTAAGAATCCCTGAAACC b. R´ CCCAAATGATTTCTGCTGGT ¿A qué organismo y gen corresponde esta secuencia, cuál es el tamaño del fragmento a amplificar? Teniendo en cuenta los parámetros vistos en clase, ¿cree usted que es una buena pareja de primers, qué condiciones mejoraría? Organismo: Candida Albicans (ERG11) Tamaño: 407 pbs Teniendo en cuenta los parámetros vistos en clase, se puede decir que es una buena pareja de primers ya que se encuentra dentro del rango de Tm adecuado (40-60°C) y las Tm de cada primer se encuentran cercanas entre sí (ΔTm = 0,45°C); además, la autocomplementariedad en 3’ es 0 para ambos primers. Por otra parte la autocomplementariedad general del Reverse primer es un poco alta, aun cuando no se pasa de 8 , por lo que sería bueno mejorar esa condiciones, de que no se auto-complementen tanto.

Bibliografía: Iserte, J.A., Stephan, B.I., Goni, S.E., Borio, C.S., Ghiringhelli, P.D., Lozano, M.E. (2013) Family-specific degenerate primer design: a tool to design consensus degenerated oligonucleotides. Biotechnol Res Int 2013:38364 Degenerate Primer Design. (s. f.). Recuperado 18 de octubre de https://assets.geneious.com/manual/11.1/GeneiousManualsu128.html

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Melting Temperatures of Oligonucleotides. (s. f.). Recuperado 18 de octubre de 2018, de https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/oligos-meltingtemp.html

Whitman M., (2008) The importance of melting temperature in molecular biology applications. Recuperado 18 de octubre de 2018, de https://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/the-importance-of-tm-inmolecular-biology-applications

Universal Primer List. (s. f.). Recuperado 18 de https://www.lslabs.com/resources/universal-primer-list

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