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Tema 7. Análisis de secuencias de ADN (método Sanger). Programas para diseño de primerspara PCR
Análisis de secuencias de ADN
Agradecemos a la Dra. Andrea Puebla de la Unidad de Genómica del Instituto de Biotecnología del CNIA-INTA varias de las imágenes de cromatogramas que noscedió gen...

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21/7/2021

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Curso Introducción a la Bioinformática. Aplicaciones en Agricultura. >

Tema 7. Análisis de secuencias de ADN (método Sanger). Programas para diseño de primers para PCR Análisis de secuencias de ADN Agradecemos a la Dra. Andrea Puebla de la Unidad de Genómica del Instituto de Biotecnología del CNIA-INTA varias de las imágenes de cromatogramas que nos cedió gentilmente para esta sección. Los servicios de secuenciación de ADN envían los resultados de sus análisis como secuencias en formato fasta y además incluyen, o deberían incluir siempre, el cromatograma que produce el equipo junto con la información de calidad de la secuencia base a base. Un formato común para almacenar esta informacion es .scf, que permite guardar en el mismo archivo el cromatograma, la secuencia y la información de calidad en el mismo archivo. Varios programas bioinformáticos que procesan grandes cantidades de secuencias utilizan la información de calidad para optimizar, por ejemplo, el ensamblado de contigs. Pero también en aquellos casos en que trabajamos con unas pocas secuencias que vamos a procesar a mano, es útil contar con el cromatograma y la información de calidad para determinar si la secuencia necesita alguna edición. Un análisis visual de los cromatogramas sirve para descubrir fácilmente algunos de los problemas comunes que pueden tener las secuencias. Un cromatograma de buena calidad muestra picos únicos, bien separados entre sí y con poco ruido de fondo:

En la figura de más abajo vemos un cromatograma con una alta señal inicial que después decae rápidamente. Esto ocurre en aquellos casos en que hay poco ADN en la muestra o las concentraciones de los primers de la reacción de secuenciación son muy bajas. También se observan cromatogramas con este perfil en presencia de contaminantes o cuando los primers son poco específicos.

En el cromatograma siguiente se observan picos bien separados y con una altura adecuada, pero hay mucho ruido de fondo. El problema es que la relación señal a ruido es baja, y esto puede deberse a que la concentración del ADN es baja o a la presencia de cantidades importantes de contaminantes. Otra situación que puede generar cromatogramas con estos defectos en cuando los primers de secuenciación tienen un sitio de unión secundario de menor afinidad que el sitio principal o a una falla en la purificación del ADN, que deja remanentes de reacciones anteriores de PCR.

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En el caso siguiente vemos que hay dos secuencias superpuestas. Es decir, ocurren dos reacciones de secuenciación, esto puede ocurrir porque los primers de la reacción de secuenciación tienen más de un sitio de binding, por presencia de primers de PCR de pasos anteriores que no se eliminaron en los pasos de purificación o por la existencia de más de un tipo de ADN molde.

En este último ejemplo vemos que la cantidad de producto de la reacción de secuenciación cae repentinamente. Esto suele ocurrir cuando hay estructuras secundarias en el ADN, lo que normalmente se soluciona en el laboratorio agregando DMSO a la reacción. Las regiones ricas en CG tienden a formar estructuras secundarias más estables.

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Cromatogramas para analizar cromatograma_1b.scf cromatograma_1d.scf cromatograma_2b.scf cromatograma_2d.scf

Los métodos de secuenciado de nueva generación se desarrollan en el Tema 6

Diseño de primers para PCR El material sobre diseño de primers para PCR lo pueden encontrar en este archivo (pdf). La secuencia para practicar es secuencia_PCR.fasta y la región que debe quedar dentro del producto de amplificación es: TCTCTGAAAATCAGAAGAGGCTAAAGAAACGACATGCAAT Sitios web útiles: Primer3Plus. Interfaz web para una variante mejorada de Primer3 PriFi. Una herramienta para diseñar primers a partir de un alineamiento múltiple de nucleótidos. BatchPrimer3. Diseño de primers sobre lotes de secuencias. Un sitio que complila varias herramientas para diseño de primers de PCR: http://www.bitnos.com/pcr-primers-design

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