TD de Spécification de l’axe dorso-ventral chez la drosophile PDF

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Summary

C'est la correction de TD qui peut nous aider à savoir sur l'axe dorso-ventral chez les drosophiles. La document de TD est trouvable dans le Claroline Connect....

Description

Spécification+de+l’axe+dorso-ventral+chez+la+drosophile+ ! ! Qst1:!Quel!est!le!principe!de!l’hybridation!in!situ?! bien!revoir!la!technique!d'HIS!en!détail!dans!le!diaporama!«!techniques!essentielles!en! biologie!du!développement.! En!quelques!phrases!:!ici!on!parle!d’HIS!sur!ARN!et!non!sur!ADN.!L’HIS!permet!de!mettre! en!évidence!la!position!d’ARN!d’intérêt!dans!un!tissu/un!embryon.!Pour!cela!on! synthétise!une!sonde!constituée!d’un!brin!d’!ARN!complémentaire!à!l’ARNm!ciblé.!Cette! sonde!est!marquée!par!des!molécules!organiques!particulièrement!(biotin,!digoxigenin,! fluorescein).!On!applique!ces!sondes!sur!les!coupes!ou!les!embryons!entiers! perméabilisés!et!on!laisse!l’hybridation!entre!ARNm!et!sonde!se!faire.!On!révèle!la!sonde! avec!des!anticorps!dirigés!contre!la!molécule!organique!fixée!à!la!sonde,!ces!anticorps! étant!eux-mêmes!couplés!à!une!enzyme!capable!de!convertir!un!substrat!en!produit! coloré.! ! Qst2:!Analysez!la!figure!4!et!conclure.! -Description:!Chez!l'embryon!wt,!les!ARNm!Dpp!sont!localisés!au!niveau!dorsal!et!les! ARNm!Snail!au!niveau!ventral.!Chez!les!embryons!mutants!dl!(mutants!perte!de! fonction),!on+observe+une!présence!des!ARNm!Dpp!au!niveau!dorsal!et!aussi!une! présence!ectopique!des!ARNm!Dpp!au!niveau!ventral.!On!observe!aussi!une!perte!des! ARNm!Snail! Conclusion:!Les!protéines!Dl!inhibent!l'expression!des!ARNm!Dpp!et!activent! l'expression!des!ARNm!Snail!au!niveau!ventral.! Au!fur!et!à!mesure!des!questions,!on!schématise!ces!conclusions!dans!un!modèle! mécanistique!(voir!schéma!final)! ! Les!embryons!mutants!dl!sont!en!fait!issus!d’un!croisement!entre!une!femelle!dl-/dl-!et! un!mâle!dl+/dl+.!dl-!est!récessif!sur!dl+.! Qst3:+Que!conclure!de!ces!informations!supplémentaires?!Faites!un!schéma!expliquant! cette!situation!paradoxale!en!apparence.! -L'embryon!"mutant!dl"!est!donc!hétérozygote!dl+/dl-!et!pourtant!il!a!un!phénotype! anormal.!Sa!mère!est!dl-/dl-!et!de!phénotype!normal!et!se!reproduit!normalement.!Il!y!a! donc!un!décalage!de!génération!entre!le!génotype!dl-/dl-!et!le!phénotype!anormal.!C'est! typique!d'un!gène!à!effet!maternel.! ! !Schéma!pour!comprendre!cette!notion:!lors!de!l'ovogenèse!chez!la!mère,!des!ARNm!et! des!protéines!dl!sont!exprimées!à!partir!du!génome!maternel!(ici!dl-/dl-).!Ces!ARNm!et! protéines!dl!sont!accumulées!dans!l'ovocyte!et!vont!être!gardés!en!stock!jusqu'à! l'embryogenèse.!Ils!vont!servir!au!développement!de!l'embryon,!tant!que!le!génome!de! l'embryon!(zygote)!ne!s'exprime!pas.!Donc!même!si!l'embryon!est!hétérozygote,!son! génome!n'apporte!pas!de!version!fonctionnelle!de!la!protéine!dl.!Les!protéines!dl! présentes!sont!issues!de!la!mère!et!donc!non!fonctionnelles.!D'où!le!phénotype!anormal! chez!l'embryon.!La!mère!elle-même!a!pu!naître!d'une!mère!+/-!et!donc!hériter!des! protéines!fonctionnelles!de!dl+!pour!se!développer!correctement.! !

ovaire' génotype'dl3/dl3' cellules'nourricières'

spermatozoïde'(génotype'dl+)'

ARNm%dl(% ARNm%dl(%

ovocyte'

zygote'(dl+/dl3)' !

! Qst4:!Analysez)et)interprétez)les)marquages)de)la)figure)5)concernant)Dl.)Vous! considérerez!ces!marquages!à!l'échelle!globale!de!l'embryon!et!à!l'échelle! subcellulaire.!Compte-tenu!de!la!localisation!de!Dl!dans!l’embryon!et!des!conséquences! de!son!invalidation,!comment!pourrait-on!qualifier!le!rôle!de!Dl?!Quel!est!l’intérêt!de! montrer!l’immunomarquage!anti-Dl!sur!le!mutant!dl?! ! -Bien!revoir!la!technique!de!l'immunomarquage!(voir!diaporama!«!techniques! essentielles!en!bio!du!dev!»)! -On!observe!que!la!protéine!Dl!est!présente!au!niveau!ventral!du!blastoderme!cellulaire,! avec!un!gradient!ventral-dorsal,!la!protéine!est!accumulée!dans!les!noyaux.! La!localisation!nucléaire!de!la!protéine!Dl!suggère!qu'elle!pourrait!être!un!facteur!de! transcription!et!sa!distribution!en!gradient!!et!ses!effets!sur!la!patterning!dorso-ventral! suggère!un!rôle!de!morphogène! ! -On!peut!remarquer!l'absence!de!marquage!chez!le!mutant!dl!(controle!négatif),!ce!qui! garantit!la!spécificité!de!l'anticorps!anti-Dl,!et!la!perte!de!fonction!de!la!mutation!dl-.! ! ! Qst5:!Des!chercheurs!ont!obtenu!une!mutation!récessive!du!gène!cactus!(cactus-).!! Ils!ont!réalisé!des!immunomarquages!de!Dl!sur!des!embryons!issus!de!mère!cactus/cactus-!et!de!père!sauvage.!Analysez)les)résultats)de)la)figure)6)et)concluez.! -Description:!Alors!que!la!protéine!Dl!est!présente!au!niveau!ventral!de!l'embryon! sauvage,!on!observe,!chez!les!mutants!issus!de!mère!cactus-/cactus-,!une!expression! ectopique!de!la!protéine!Dl!au!niveau!latéral!et!dorsal!du!blastoderme! -Conclusion:!Cactus!inhibe!l'expression!de!Dl!au!niveau!latéral!et!dorsal!du!blastoderme.! Cactus!est!aussi!un!gène!à!effet!maternel.! ! ! Qst6: Faites un sch.ma r.capitulant la position des expressions de Dl, Snail et Dpp et leurs influences l’échelle de l’embryon drosophile (vue en coupe transversale). ! !

Dos#

ARNm#Dpp#

ARNm#Dpp#

+# ARNm#Snail# Dl# -# ARNm#Dpp# ventre#

! ! + Qst7:&Faites'une'hypothèse'sur'le'mode'd’action'du'facteur'Dl'à'l’échelle'moléculaire'dans'les' cellules&ventrales&du&blastoderme.&(faire&un&schéma&de&ce&mode&d’action) Dl!en!tant!que!facteur!de!transcription!pourrait!se!lier!au!promoteur!du!gène!Snail!pour! activer!sa!transcription!et!au!promoteur!du!gène!Dpp!pour!inhiber!sa!transcription! + Qst8:!Des$chercheurs$ont$obtenu$une$mutation$récessive$du$gène$cactus$(cactus-).# Ils$ont$réalisé$des$immunomarquages$de$Dl$sur$des$embryons$issus$de$mère$cactus-/cactus-! et#de#père#sauvage.#Analysez)les)résultats)de)la)figure)6)et!concluez.! ! On observe une expression ectopique de la protéine Dl dans les noyaux latéraux et dorsaux du blastoderme de la drosophile issus de mère cactus-/- et de père sauvage, ainsi qu’une surexpression dans les noyaux ventraux, alors que la protéine Dl est seulement exprimée dans les noyaux ventraux chez les embryons sauvages. Donc Cactus inhibe l’expression de la protéine Dl dans les cellules latérales et dorsales de l’embryon de drosophile au stade blastoderme. Cactus est donc probablement un facteur dorsalisant, crucial dans la spécification de l’axe dorso-ventral chez la drosophile De plus le fait que l’embryon analysé soit cactus +/- et qu’il ait un phénotype anormal et que sa mère est de génotype cactus-/- indique que cactus est un gène à effet maternel. Qst9:!Selon&vous,&quel&phénotype&peut-on#attendre#chez#ces#embryons#cactus+/cactus-!de#la# question)8? On!peut!penser!que!ces!embryons!sont!ventralisés!,!donc!avec!une!expansion!importante! du!territoire!mésodermique!latéralement!et!peut-être!aussi!une!expansion!du! neurectoderme!au!niveau!dorsal.! ! Qst10:!La!figure!7!montre!un!immunomarquage!anti-Cactus!dans!un!embryon!sauvage.! Au)regard)des)résultats)précédents,)proposez)une)hypothèse)sur)le)rôle)moléculaire)de) Cactus)dans)les)cellules)du)blastoderme.! !

On!observe!que!la!protéine!cactus!est!localisée!dans!la!région!latérale!et!dorsale!du! blastoderme,!au!niveau!cytoplasmique.! -Hypothèse:!la!protéine!Cactus!inhiberait!l'expression!ou!l’accumulation!de!la!protéine! Dl,!soit!en!inhibant!sa!traduction,!soit!en!activant!sa!dégradation,!ou!en!bloquant!son! import!dans!le!noyau.! ! ! Qst11:!Des!chercheurs!ont!identifié!un!site!de!phosphorylation!sur!la!protéine!Cactus.! Ils!ont!généré!une!mutation!de!ce!site!de!manière!à!le!rendre!non!phosphorylable,! obtenant!ainsi!l'allèle!cactusSA.!Des!ARN!d'allèle!cactus!sauvage!(cactuswt)!ou!muté! (cactSA)!ont!été!injectés!dans!des!embryons!avant!la!segmentation.!Les!résultats!ont!été! résumés!dans!le!tableau!1.! Analysez)ces)résultats)et)concluez! ! -Description:!l'injection!d'ARNm!Cactus!wt!n'a!pas!d'effet!particulier!par!rapport!au! controle!non!injecté.!En!revanche,!l'injection!d'ARNm!Cactus!codant!une!protéine!cactus! SA!non!phosphorylable!provoque!une!dorsalisation!systématique!des!embryons.! Conclusion:! L'absence!de!phosphorylation!de!cactus!rend!donc!la!protéine!dorsalisante!,!et!donc! constitutivement!active!au!niveau!ventral!aussi!bien!que!dorsal!de!l'embryon.! ! Qst12:!D'après!ces!résultats,!quel)pourrait)être)l'effet)de)la)phosphorylation)de)Cactus) dans)la)situation)sauvage?! La!phosphorylation!de!ce!résidu!est!donc!nécessaire!à!l'activité!régulée!de!la!protéine! cactus.!Elle!semble!permettre!une!inhibition!de!l'activité!de!cactus!au!niveau!ventral.! Etant!donné!que!la!protéine!cactus!n'est!pas!révélée!par!l'immunomarquage!au!niveau! ventral!chez!le!sauvage!(fig!7),!la!phosphorylation!pourrait!avoir!comme!conséquence!la! dégradation!de!la!protéine!cactus!au!niveau!ventral!! ! Qst13:!!La!protéine!Toll!est!un!récepteur!transmembranaire!localisé!à!la!membrane! plasmique!de!l’embryon,!du!stade!oeuf!au!stade!blastoderme!cellulaire.!Des!chercheurs! ont!obtenu!deux!allèles!différents!du!gène!toll,!tollin!et!tollgof.!L'allèle!tollin!code!pour!un! récepteur!ne!pouvant!pas!se!lier!à!son!ligand.!L'allèle!tollgof!code!pour!un!récepteur! activé!de!manière!constitutive!(en!présence!ou!absence!de!ligand).!! Les!embryons!issus!de!mère!tollin/tollin!et!de!père!sauvage!présentent!un!phénotype! dorsalisé.!Les!embryons!de!mère!tollgof/tollgof!présente!un!phénotype!ventralisé.! !Qu'en)déduire)sur)le)rôle)de)Toll?! ! Toll!est!un!gène!à!effet!maternel.!Ce!récepteur!spécifie!l'identité!ventrale!des!cellules! quand!il!est!actif.! ! Qst14:!Des!chercheurs!ont!effectué!un!immunomarquage!de!Dl!sur!des!embryons!issus! de!mère!tollin/tollin!ou!de!mère!tollgof/tollgof!(!fig.!8).! Analysez!la!figure!8!et!concluez.! ! Description:! On!observe!que!les!protéines!Dl!sont!exprimées!de!manière!ectopique!latéralement!et! dorsalement!chez!les!embryon!tollgof/tollgof.!Les!protéines!Dl!sont!absentes!chez!les! embryons!tollin/tollin.!!

Conclusion:!Toll!est!nécessaire!et!favorise!l'expression/l'accumulation!de!la!protéine!Dl.! Dans!la!situation!sauvage,!Toll!semble!être!activé!au!niveau!ventral!pour!permettre! l'expression!de!Dl.! ! !

Drosophile:# blastoderme# cellulaire#(C.T.)#

Récepteur#Toll#

actus# DORSAL#

Dl# phosphoryl

actu

C

P#

ac+va+on#de#Toll# !

VENTRAL#

!...