TD L1 microbiologie PDF

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10 exercices de TD ...

Description

UE OVIV – Microbiologie Travaux Dirigés Avant de venir en TD, il est fortement recommandé de faire les exercices et de rechercher (Cours, Bibliothèque, Internet…) des informations sur : - La présence de micro-organismes procaryotes dans des environnements divers. - Les constituants de milieux nutritifs (Tryptone, Extrait de levure, ...). - La stérilisation. - La multiplication des procaryotes. - Les notions de pourcentage massique, molarité, normalité, dilution… - Les éléments facultatifs et obligatoires chez les procaryotes. - La structure et la fonction de la paroi chez les procaryotes. - Les notions de métabolisme bactérien. - La composition des acides nucléiques et les notions correspondantes utiles pour la classification (% G+C, Tm). - Les définitions des espèces chez les procaryotes. Une partie du premier TD est consacrée à la vérification de ce que vous avez compris lors de la séance de TP. Au cours du dernier TD, en fin de semestre, des éléments de correction du contrôle continu de début décembre seront apportés.

Exercice 1 Un technicien d’un laboratoire de microbiologie prépare un bouillon nutritif (pour 1 L : 5 g de NaCl, 10 g de tryptone, 5 g d'extrait de levure, pH = 7). Il répartit ce bouillon nutritif dans des tubes propres à raison de 5 mL par tube. Le technicien est obligé de partir et il ne revient au laboratoire que le lendemain. Il observe les tubes préparés la veille et constate que tous les bouillons nutritifs sont entièrement troubles. 1 A quoi servent les différents constituants du bouillon nutritif ? Pourquoi le milieu est-il ajusté à pH 7 ? Quels types d'espèces bactériennes peuvent se multiplier dans ce milieu ? 2 Comment expliquez-vous le trouble observé dans les bouillons nutritifs ? Est-ce que ces bouillons nutritifs peuvent être utilisés pour réaliser des cultures pures ? 3 Qu'aurait dû faire le technicien avant de partir ? Décrivez la procédure.

Exercice 2 Des travaux d'un laboratoire consistent à analyser les caractéristiques d'une souche bactérienne. Pour cela, les cellules bactériennes ont été cultivées dans un milieu nutritif liquide. Après incubation à 37°C pendant 24h, un trouble est observé. Il est considéré qu'une population liquide avec un trouble visible à l’œil nu 8 contient environ 10 organismes/mL. Pour l'étude des caractéristiques de cette souche bactérienne, le technicien ne veut observer qu'une dizaine de colonies sur une gélose nutritive (milieu nutritif gélosé, c'est à dire additionné d'agar pour le solidifier dans la boîte de Pétri). Ne connaissant pas cette souche bactérienne, il a décidé d'observer le développement des colonies. Le tableau suivant résume ses observations. Temps d'observation après le début de l'incubation 3h 6h 9h 12 h 18 h 24 h 48 h

Diamètres des colonies Non visible Non visible Non mesurable 1 mm 2 mm 2,5 mm 3 mm

72 h

3 mm

En considérant que chaque cellule bactérienne représente un rectangle de 3 µm x 1 µm, et qu'une boîte de Pétri a un diamètre de 9 cm : 1. Quel est le nombre maximum de cellules bactériennes pouvant tenir sur la surface de la boîte ? 2. En considérant la taille des colonies après 18h d'incubation, combien de colonies pourraient être présentes à la surface de la gélose nutritive ? 3. Combien de cellules y a-t-il dans 0,1 mL de la population liquide ? 4. Si l’on étale ces 0,1 mL sur la boîte, pourra-t-on observer après incubation dans les conditions adéquates des colonies isolées ? 5. Que proposez-vous pour que cela soit le cas ? 6. Comment expliquez-vous les résultats consignés dans le tableau ?

Exercice 3 Etude d'un échantillon d'eau de mer. Un volume de 0,1 mL d'eau de mer (concentration équivalente en NaCl = 24 mg/mL) prélevée à la surface, est ajouté dans chacun des 5 tubes de milieu nutritif notés A (5 mL) préalablement additionné de 0, 100 mg, 250 mg, ou 500 mg de chlorure de sodium (NaCl). Ensuite, les tubes inoculés (A) et non inoculés (T) sont incubés à 25°C pendant 4 jours. Les résultats obtenus sont décrits dans le tableau suivant : Tubes (N°)

A1

A2

A3

A4

T1

T2

T3

T4

Vol eau de mer ajouté (mL) NaCl (g/tube)

0,1 0

0,1 0,1

0,1 0,25

0,1 0,5

0 0

0 0,1

0 0,25

0 0,5

+

+++

+/-

-

-

-

-

-

eau de mer

[NaCl] en g/L [NaCl] en mol/L Trouble après 4 j à 25°C

1 Calculez la concentration en NaCl en g/L et en mol/L (la masse molaire du NaCl est de 58,44 g/mol) dans les différents tubes (le volume d'eau de mer qui est ajouté, est considéré comme négligeable). 2 Quel peut être l'effet du NaCl sur les bactéries ? 3 Pourquoi observe t'on un trouble, à quoi ce trouble peut-il correspondre (espèces, souches différentes) ? 4 Quels sont les différents éléments qui peuvent influencer les résultats obtenus ? 5 Quelles hypothèses peut-on définir pour chaque tube ? Quelles expériences supplémentaires pourraient être réalisées pour approfondir les connaissances sur la composition microbienne de cet échantillon ?

Exercice 4 A partir de cultures pures de 2 souches bactériennes (A et B), différentes cultures en milieu complet liquide sont réalisées. Le tableau ci-dessous résume les conditions de culture et les observations obtenues. Atmosphère (la [O2] de l'atmosphère est égale à 20%)

[O2] = 20%

[O2] = 5%

[O2] = 0,0001% (1)

1. 2. 3. 4.

Température d'incubation 42°C 30°C 20°C 42°C 30°C 20°C 42°C 30°C 20°C

(1)

Observation d'un trouble Culture A Culture B ++ +/+/++ ++ +/+/++ +/-

: - : pas de trouble ; +/- : léger trouble ; ++ : trouble important

Qu'est-ce qu'une culture pure ? Comment est-elle réalisée ? Analysez le tableau ci-dessus. Emettez des hypothèses. Quelles manipulations supplémentaires pourriez-vous effectuer ?

1

Exercice 5 Des investigations réalisées lors d'une infection alimentaire ont mis en cause un lot de yaourt. Pour vérifier cette hypothèse, différentes analyses microbiologiques sont effectuées sur le lot supposé causer l'infection (lot S) et un lot témoin (lot T). Les premières analyses correspondent à des colorations de Gram sur des gouttes de yaourt provenant de chaque lot, et à des isolements sur gélose nutritive qui furent incubées à 30°C pendant 24h en aérobiose. Les résultats de ces analyses sont présentés dans la figure 1. Les tests d'identification supplémentaires ne peuvent se faire qu'à partir de cultures pures (méthode d'isolement sur gélose nutritive ou méthode de culture en bouillon).

Figure 1 : Résultat des colorations de Gram et des isolements sur gélose nutritive des yaourts S (suspect) et T (témoin) 1. 2. 3. 4. 5.

Donnez les définitions d'une espèce bactérienne et d'une colonie bactérienne Donnez les étapes de la coloration de Gram et leur utilité. Expliquez la différence entre des bactéries Gram + et Gram - en vous aidant de schémas annotés. Analysez les résultats de la figure 1 et émettez des hypothèses. Donnez au moins trois tests phénotypiques supplémentaires pour mettre en évidence des caractéristiques métaboliques ou biochimiques pour identifier les bactéries présentes dans le yaourt (lots S et T).

Exercice 6 3 bactéries A, B et C sont soumises à un certain nombre d’expériences ou de tests dont les résultats sont résumés dans le tableau suivant : Test ou observation / bactéries

A

B

C

Vésicule

Bâtonnet

Bâtonnet

Taille moyenne (µm)

0,2

7

4

1. Effet d’un choc hypo-osmotique

Lyse

Pas de lyse

Pas de lyse

2.Changement de forme traitement au lysozyme

Non

Oui

Non

Forme

après

Type de structure

1. A l’aide des connaissances acquises en cours, proposez des hypothèses pour expliquer les résultats observés à partir des 2 expériences réalisées pour chacune des bactéries. Complétez le tableau pour la structure des 3 bactéries. Quelle coloration de Gram devriez-vous observer ? 2. Quelles seraient les conséquences d'un traitement à la pénicilline sur les trois bactéries ? Expliquez. 3. Un mutant Z de la souche C est observé au microscope électronique et il est apparu que de fines structures n'étaient pas présentes à la surface des bactéries. La souche C et son mutant sont injectés à deux lots différents de souris. Le lot injecté avec la souche C meurt en 72 h ; le lot injecté par le mutant Z se porte bien. Proposez une explication.

2

Exercice 7 La figure 7-1 représente des valeurs d'absorbance* de l'ADN lors de sa dénaturation au cours des hybridations expliquées ci après : ! A-A : entre l'ADN chromosomique de la souche A (homoduplex A-A) ! A-B : entre l'ADN chromosomique de la souche A et l'ADN chromosomique de la souche B (hétéroduplex A-B) ! A-C : entre l'ADN chromosomique de la souche A et l'ADN chromosomique de la souche C (hétéroduplex A-C) Rappel : l'absorbance de l'ADN simple brin est plus élevée que l'ADN double brin

Figure 7-1 : Absorbance* de l’homoduplex A-A et des hétéroduplex A-B et A-C en fonction de la température (*) : L’absorbance est une mesure de la propriété des molécules à absorber des photons à une longueur d’onde donnée. Cette absorbance varie en fonction de la concentration des molécules ou de leur structure secondaire (cas de l’ADN bicaténaire et monocaténaire). Les termes « densité optique », « opacité » ou « extinction » sont également utilisés.

1. Calculez le Tm de l'homoduplex A-A et des hétéroduplex A-B et A-C. 2. En fonction de la différence de Tm, déterminez si les souches A, B et C appartiennent à la même espèce. 3. L’ADN chromosomique d’une quatrième souche (D) est hybridée avec l’ADN de la souche B. Le Tm de l’hétéroduplex B-D est de 66°C. Que pouvez-vous émettre comme hypothèse(s) ? Quelles sont les expériences supplémentaires que vous pourriez faire pour valider cette ou ces hypothèses ?

Exercice 8 Dans des travaux visant à déterminer si la souche bactérienne dénommée SB1 est de l'espèce Escherichia coli (Ec) ou de l'espèce Bacillus subtilis (Bs), le chercheur va déterminer les pourcentages en G+C et les températures de demi-dénaturation (Tm) de différentes molécules hybrides (homoduplex et hétéroduplex). Les résultats sont présentés dans les tableaux ci-dessous : Espèce/ souche % G+C Tm Ec-Ec 85 °C Tm Bs-Bs Ec 51 % 80 °C Tm Ec-SB1 Bs 42 % 82°C Tm Bs-SB1 SB1 51,5 % 71°C 1. Expliquez à quoi correspondent les notions " % en G+C" et "température de demi-dénaturation. 2. Analysez les résultats obtenus et concluez pour la souche SB1 pour son appartenance à l'espèce Escherichia coli ou Bacillus subtilis.

3

Exercice 9 Dans un laboratoire spécialisé dans l'étude des micro-organismes présents dans la panse des bovins, un chercheur étudiant les procaryotes s'intéresse à deux d'entre eux et il a réalisé différentes expériences : (1) observation au microscope après coloration de Gram, (2) sensibilité au lysosyme, (3) détermination des composants de la paroi et (4) analyse de la composition de la membrane cytoplasmique. Les résultats des différentes expériences sont décrits dans le tableau ci-dessous. Expériences Coloration de Gram Sensibilité au lysosyme Composants de la paroi Composition de la membrane cytoplasmique

Procaryote 1 Batonnet 2 µm de long et de 0,5µm de large Violet Non N acétyl glucosamine + acide N acetyl talosaminurique - Isoprènes ramifiés - Liaisons ether - L Glycerol

Procaryote 2 Coque diamètre de 0,6 µm Violet Oui N acétyl glucosamine + acide N acetyl muramique - Acides gras non ramifiés - Liaisons ester - D Glycerol

1. Pourquoi ces deux procaryotes sont-ils colorés en violet ? 2. Comment réaliseriez-vous l'expérience de sensibilité au lysosyme ? 3. Parmi les caractéristiques, quelles sont celles qui sont déterminantes pour l'établissement des phyla de procaryotes ? 4. Après l'analyse de l'ensemble de ces résultats, émettez une hypothèse sur la classification de ces deux procaryotes. 5. Quelle technique utiliseriez-vous pour valider votre hypothèse ?

Exercice 10 – Révisions Indiquez si les propositions suivantes sont vraies ou fausses en cochant la case adéquate. N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Propositions Dans l'arbre de Carl Woese (1990), deux lignées sont représentées pour les procaryotes. Les cellules bactériennes peuvent avoir des dimensions comprises entre 0,1 et 200 à 300 µm. Les procaryotes se reproduisent par scissiparité. Un bacille correspond à une colonie allongée. Les Archaea peuvent être à coloration de Gram positive ou négative. Toutes les bactéries peuvent former des endospores. Les ribosomes sont des structures facultatives Les procaryotes possèdent des noyaux délimités par une membrane nucléaire. C'est A Yersin (1894) qui a mis en évidence que l'agent causal de la peste était une bactérie La coloration de Gram est basée sur la perméabilité de la capsule. Une colonie bactérienne est un amas de bactéries possédant des caractères distincts La membrane plasmique est une structure obligatoire présente chez les procaryotes Les organismes utilisant la respiration aérobie consomment de l'O2 Les cellules bactériennes ne contiennent pas de mitochondries Les firmicutes sont des bactéries avec une épaisse paroi de peptidoglycane. La notion de Procaryote a été définie par E Chatton (1937) Les flagelles sont impliqués dans la mobilité des bactéries. Les procaryotes comprennent les Archaea et les Bacteria Une colonie bactérienne peut grossir indéfiniment Les cyanobactéries seraient à l'origine des chloroplastes

Vrai

Faux

Faites un schéma d'une bactérie, représentez et légendez les structures obligatoires et facultatives.

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