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Microbiologie 2 Potier (À partir de la diapo 51 de la partie 1)

Test d’immunodiffusion « d’OUCHTERLONY » : En milieu solide avec de l’AGAR noble avec des trous, on dispose des antigènes reconnaissables par des anticorps. Ils diffusent sur le gel cela sera vu par des arcs de précipitation (= un anticorps reconnaît un antigène). En fonction de l'axe de précipitation on peut estimer quelques informations. Si on a un arc comme en (a) qui se forme on a une identité entre les 2 Antigène (b) arc de précipitation différent avec une partie en commun= identité partielle (bact diff mais des propriétés antigéniques en commun). (c) Si on a 2 arcs de précipitation qui se forme alors Agène 6 et 7 sont différent tous les 2. -

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Réactions d’agglutination :

Les réaction agglutination, l’agglutination permet d’identifier des bact on met un Acorp (ici IgM). Utilisation de particule (bille de latex) avec les anticorps. Les bactéries se fixent aux anticorps  formation d’un réseau d’interaction et agglutination. C’est très visible sur une lame de verre. Le milieu change de structure quand on a reconnaissance entre les Acorp et Agène. C’est extrêmement simple. On a plusieurs moyens de faire ça : Le moyen avec des grosse bille de latex érigé avec Agène (soluble= polysaccharide bact par exemple) puis on ajoute notre solution Acorp formation de liaison =précipitation. Grosse bille de latex avec érigé Acorp et solution Agène. Reconnaissance et précipitation. -

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On se base sur la spécificité de reconnaissance entre Agène et Acorp car les Acorp seront capable de fixer les Agène qui ont déclenché leurs synth. MAIS en réalité ils seront cap de se fixer sur tout et n’importe quoi. Il faut oublier la spécificité Agène/Acorp car Acorp réagit avec tous et n’importe quoi.

Marquage des anticorps : Pour voir nos expériences on peut marquer avec des Acorp :

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Direct : Greffe molécule radioactive ou greffe enzyme sur la chaine lourde de Acorp. Ici : On a Acorp et on lui greffe une ENZ. On met en évidence la réaction grâce à l’enzyme à qui on apporte le substrat=Production d’un produit coloré.

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Marquage du conjugué : Pour produire ce conjugué on fait produire les Acorp. On produit une culture bact pure qu’on injecte à un animal (lapin). On obtient sérum avec Acorp dirigé contre bact de la culture. Purification des Acorp primaire que l’on fait réagir sur ce que l’on veut déterminer. On les fait agir sur la bactérie. Puis on prod des Acorp secondaire. On prélève Acorp de lapin qu’on injecte dans un autre animal qui vas prod des Acorp anti-Acorp de lapin=conjugué que l’on va marquer avec enzyme. Ac secondaire reconnait Ac de lapin et avec l’enzyme et le substrat on a production d’un produit coloré. Intérêt : Ac 2nd se fixe à plusieurs sur Ac de lapin. Plus il y a d’enzyme, plus le marquage sera fort et la sensibilité de détection sera élevé. Permet identification. Problème on a des variations, le rendement change.

Méthode ELISA (Enzyme Linked Immunosorbant Assay) : Méthode de base en immuno-détection. 2 manières : -

En double sandwich : on prend des cupules ou on fixe les Acorp, (PH : 9 = fixation de ch lourde). Tapisser par Acorp, on ajoute une Prot saturante des sites au fond cupule (lieu sans Ac). Ajout Agène, puis on rince pour enlever ce qui n’est pas fixer. On fait agir Ac primaire en ajoutant Ac (=le même que Ac fond cupule mais marqué par une Enz). Ajout du substrat et coloration.

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Essai indirect : On met au fond cupule des Agène, on tapisse encore les cupules (avec Ag). Ajout Ac primaire puis ajout d’un conjugué dirigé contre Ac primaire. Le conjugué porte l’enzyme. On rince pour enlever ceux pas assos et on ajoute le substrat de l’enzyme et on a coloration.

Intérêt : indirect, beaucoup de conjugué se fixeront à Ac primaire. ↑sensi de détection. Le double sandwich, solution Agène inconnu avec concentration inconnu. En fixant les Acorp on vas pouvoir apporter des solutions différentes. Système permettant de concentrer les bactéries et de les piégé (alors qu’elle st dans solution dilué). On peut utiliser un spectrophotomètre capable de lire des plaques de 96 puits. Permet estimer les quantité Agène détecter par les Ac. C’est très utilisé et simple à mettre en œuvre. Problème : il y a des faux positifs car Ac se fixe n’importe où.

Méthodes électrophorétiques : Immuno-électrophorèse Utilisé en milieu hospitalier. Permet de confirmer un diagnostic et de savoir l’efficacité d’un traitement Abio. On la prescrit pour diagnostiquer un état pathologique sous-jacent. On sépare Agène présent dans liquide biologique par électrophorèse. Lors de la séparation on les confronte à une solution qui contient mélange Ac. On a diffusion Ac et résultat comme outchterlony. En haut, solution séparée avec electropho. Ag se sépare selon leurs charges et leurs tailles (condition non dénaturante). Après séparation, formation d’une fente où on ajoute solution Ac. système équivalent à ouchterlony. Diffusion des Ac et Ag. L’équivalence des concentrations se manifeste par un arc de précipitation. Interprétation se fait par analyse des arcs et par coloration des gel (bleu comasee). Permet

de déduire la présence de tel ou tel pathogène en regardant la forme et position des arcs (se lit comme un code barre).

Méthodes électrophorétiques : Immuno détection après Western blotting On extrait les Prot de nos souches, électrophorèse SDSPAGE (les Prot porte toute même charge). Migration des Prot en fonction de leurs tailles, permet d’avoir une meilleur (gel polyacrylamide) donc meilleure séparation des Ag. électro-transfert par western bloting sur une membrane (permet accessibilité des Prot emprisonner dans le gel pour les AC). Les Prot migrent grâce au champ électrique depuis le gel sur la surface de membrane (nitrocellulose). Les Prot seront à la surf membrane et on révèle avec des Ac, on peut voir les bandes où les Ac on réagit.

La détection se fait, Prot sur memb, les Ac fixent aux Prot d’intérêt est présente. Ajout Ac conjugué et de enz (conjugué) qui permet de voir l’Agène intérêt

sections du gel où la apport des substrats sur memb.

Exemple : Cherche à mettre en évidence différente souche bactérienne. En produisant des Ac dirigé contre ss-u catalytique de l’enz nitrifiante de la bact, ils ont pu mettre en évidence par western blot que bact était toute de même sps mais que les enz st toute des enz différente. C’est la seule méthode qui est cap de mettre en évidence des variabilités intraspécifique.

Ce western blot intéressant : car il se sont intéresser à identifier cette enzyme en milieux complexe (différent). Ils ont voulu mettre en évidence le potentiel enz de communauté fonctionnelle. Grace aux Ac ils ont séparé les diff souche. Si trop Ag, réaction non spécifique=surestimation de la quantité Ag intérêt. On mesure la luminescence de la réaction. On calibre la fenêtre sur la zone 105kda =enz intérêt (enlève les bande pas spé). Permet de quantifier l’enzyme. Permet de mettre évidence variation intraspécifique et quantification extrêmement spé l’Ag d’intérêt. Exemple : on anal Ac chez patient (migration Ac) et on va tester avec des Ag spé. On prélève sang avec mélange Acélectrophorèse SDS-PAGE (séparation Prot). On dispose Ag qui corresponde au patho qu’on recherche (ex le rouge=Ag diriger contre un truc, violet Prot surf et jaune aussi). On a à disposition série Ag marqué (enz ou radioa). On a fait migrer le mél Ac du patient on fait réagir les Ag marquer. Les Ac reco les Ag et on peut facilement mettre en évidence présence Ac diriger contre Ag bact qui nous intéresse.

 Diagnostic maladie de Lyme : Bactérie(=borrelia), vecteur= tique. Borréliose= maladie de Lyme. Difficile à cultiver. On doit quand même diagnostiquer. On se bases sur les symptômes : Le signe clinique peut durer une vie entière. Borrelia est extrêmement connu chez les vétos, possède des tests de diagnostic pour la maladie. Dans le milieu médical, On peut faire un test sérologique immunologique que quand on est diagnostiqué. On dose les Ac en réponse à infection mais pas en réponse à la présence de la bactérie. Il y a 2 méthodes, Elisa et western blot. Problème, maladie chronique, 52% patient sont négatif avec Elisa alors qu’avec le western blot st testé positif. On compare profil du patient avec des profil de différents cas connu de la maladie de Lyme. Notre patient (8) et les diff profils. On regarde présence de tel ou tel bande dans échantillon de sang. Si on a 5 / 10 bandes et au bon niveau (à la hauteur des témoins) =positif. C’est possible de le faire mais les instances médicales française refusent de faire ces tests. Et le traitement est traitement Abio classique.

Microscopie à épifluorescence  Détection in situ : Permet de visualiser les bactéries en environnement complexe. On veut voir les bact se comporte. On a prod des Ac (contre bact) marqué avec un fluorochrome. Fixation aux Ag qui ont prod leur synth. Le fluorochrome émet lumière qd on l’excite avec UV et il va émettre dans le visible. On utilise un microscope particulier. Excitation fluorochrome et émission de Lum visible qui est observable. Détection in situ de bactérie.

PATHOGENIE : étude des symptômes de l’hôte : Pathologie aide à identification du pouvoir pathogène. En regardant les symptômes de l’hôte : -

Végétal collet, tumeur due hyperplasie cell vg tumefaciens agrobactérium

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Mycobactérium leprae= lèpre=les doigts qui tombe

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Fond gorge voile, diphtérie

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Nécrose des tissus Bacillus antracis (anthrax) maladie du charbon utilisé dans la guerre bactériologique

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Tétanos clostridium tetani on a contraction de tous les muscle et quand tétanie atteint poumon et cœur mort

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Clostridium perfringens responsable gangrène

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Présence gonorrhée maladie sexuellement transmissible, la chaude pisse en gros

ESPECE BACTERIENNE, IDENTIFICATION ET TYPAGE DES MICROORGANISMES : PARTIE II

APPROCHES MOLECULAIRES  Critères définissant une espèce bactérienne  Méthodes de typage des bactéries On essaie d’identifier les µorg en utilisant des techniques simples à mettre en œuvre. Simple à mettre en œuvre mais long. ce st des méthodes discriminante donc on peut identifier une SPS mais en aucun cas on peut voir s’il y a une variation individuelle dans cette espèce(intraspécifique). A part pour le western blot il est impossible d’avoir accès à l’SPS. Ce st méthode qui ne permettent pas de savoir tt les bact qui st dans un mélange et surtout on ne sait pas comment établir la véritable notion SPS bactérienne. C’est compliqué en µbiologie donc on essaie de regrouper en groupe (taxon). Le concept SPS en µbio est compliqué. On utilise ces méthodes dans de large secteur mais st insuffisants et ce sont l’évolution de ces techniques qui permet d’aller plus loin dans le typage de bactérie. On a des méthodes de typage qui permettent d’identifier tt bact présente dans environnement et qui ne nécessite pas

l’isolement des µorg. Approche moléculaire pour définir la notion de l’espèce bactérienne et des méthodes de typage sont plus efficace que celle vue précédemment.

THERMODENATURATION DE L’ADN : On peut rendre l’ADN monocaténaire en augmentant la T° =casse les liaison hydrogène. L’absorption ADN monocaténaire (adn sp brin) est plus élevée que sous forme double hélice, hyperchromicité. Adn monocat abs à 260nm. On peut définir une valeur caractéristique de la molécule adn en estimant une température pour laquelle 100% des molécule adn sont dénaturé. à la moitié de la DO de dnat total (ici=1 on passe à 0,5)  calcul du tm.

Calcul de la température de fusion (Tm) : unique pour chaque molécule adn.

On a pu déterminer le GC%, plus Tm élevé et plus %GC élevé. En gros plus on a du GC plus adn sera difficile à dénaturé. On a des bactéries qui ont des variations sur la composition des nucléotides du génome. Le GC% du génome bactérien vas varier selon le type de bactérie. Détermination du (G+C) % par thermodénaturation : Pour dter le GC% on procède à thermodénaturation. 2 liaisons H entre AT et 3 en CG. Plus on a du GC plus la température de dénaturation sera élevé ainsi que le Tm. Avec 2 souches et on voie que les 2 courbes st décalé et le Tm est différent. Si le Tm de A est très diff de B on a des SPS diff. Si Tm proche/égal on ne sait en pas trop si elle st diff et on lève cette incertitude mesurant le ∆TM. On Dnat adn des souches A et B pour les rendre monocaténaire puis refroidissement lent obtient des (=hybridation des partie complémentaire). On hétéroduplex (zones complémentaire (homologue)). Il y a des zones non homologues qui ne s’hybride pas. On dénature encore avec l’hétéroduplex, formation homoduplex. On obtient des courbes courbe en bleu=hétéroduplex. 50% de dénaturation on prend le Tm des homoduplex et hétéroduplex. Puis calcule ∆Tm=tmhomo-tm hétéro. Quand ∆Tm>7°C =SPS diff. ∆Tm>[B]. Statistiquement, la proba de rencontre de A et B plus élevé. B rencontrera que du A (presque). On obtient un hétéroduplex, on digère les zone monocaténaire (pas hybridé) avec des nucléases. On obtient les zones qui se sont

assospermet obtenir le %hybridation (homologie). Si 70% on sait as trop non plus. (Mais presque même SPS). Pour lever l’incertitude on définit une espèce bactérienne.

ESPECE BACTERIENNE : -

Définition officielle : SPS bact st souche dont %homo adn/adn >70% Et un ∆Tm...