TD1 Méthodes d\'étude en neurophysiologie PDF

Preview

Summary

TDneuro S5 L3...

Description

TD1 NPI : TECHNIQUES D'ETUDES EN NEUROPHYSIOLOGIE I- Les techniques de neuroanatomie. But : étudier la structure du système nerveux :  marquages / microscopie  techniques d'imagerie 1) Les principales étapes d'un marquage. Schéma général d'un protocole de marquage de tissus (après prélèvement) :  fixation des tissus  inclusion des tissus  coupes de tissus  colorations / révélations  visualisation : miscroscopie La fixation : But : figer les structures en les préservant, plusieurs méthodes :  déshydratation : chaleur douce  agents chimiques : alcool, acétone, chloroforme  aldéhydes : formaldéhyde (formol), paraformaldéhyde, glutaraldéhyde : permettent de perfuser le tissu pour une fixation en profondeur Produits à utiliser sous hotte, avec masque, lunettes, gants. Inclusion des tissus : Former un bloc avec un agent d'enrobage contenant l'échantillon pour pouvoir faire des coupes par la suite : bien conservés, les blocs sont quasiment éternels. 3 possibilités :  paraffine liquide 60°C : pose du tissu dans une coupelle, ajout de paraffine chaude puis refroidissement, conservation à température ambiante → microscopie optique

 résines liquides : pose du tissu dans une coupelle, ajout de résine liquide (30°C) puis durcissement par la chaleur (60°C) → bloc très dur, conservation à température ambiante → microscopie électronique

 congélation dans des résines spécifiques : tissu et résines polymères dans une coupelle, immersion dans un cryoprotectant (-80°C) refroidi par azote liquide (-160°C), stockage à -80°C → microscopie optique

Les coupes : 1 type d'inclusion = 1 type de matériel de coupe. Microtome :  réservé aux blocs de paraffine (photos diapo)  collage par la chaleur du bloc sur le porte-objet  récupération d'un ruban de coupes (épaisseur de ~20µm) = caractéristique des coupes paraffinées  dépose des rubans de coupes sur des lames de microscope et séchage par chaleur douce (30°C) → renforce l'adhérence coupe/lame

Cryostat :  réservé aux blocs congelés, c'est un microtome dans une enceinte réfrigérée (-55°C max)  récupération des coupes individuelles 1 par 1 sur une lame de microscope  température de coupe généralement -20°C  épaisseur 8/10µm (jusque 50µm)  conservation des lames à -30°C (quelques jours) jusqu'à -80°C (quasiment indéfinie) Ultramicrotome :  réservé à la microscopie électronique  couteau de verre ou de diamant  les coupes invisibles à l'oeil nu sont récupérées sur une grille flottante sur l'eau  2 types de coupes en fonction de l'épaisseur :  coupes ultra-fines : 50-100nm  coupes semi-fines : 100-500nm

Les colorations : Permettent d'identifier les composants cellulaires. A partir de coupes congelées :  le plus facile  sortir les coupes du congélateur, les laisser 20 minutes à température ambiante  décongélation et séchage  application des colorants A partir de coupes semi-fines ou ultra-fines :  la préparation est bombardée par un faisceau d'électrons qui font ressortir la forme des objets  ajout éventuel d'un agent de contraste (tétroxyde d'osmium)  particules virales :

A partir de coupes paraffinées :  le plus long et contraignant → il faut éliminer la paraffine (incompatible avec les colorants)  étapes de déparaffinage : déshydratation des coupes par bains d'alcools croissants : 20° → 40° → 60° → 80° → 2x à 100° ; 5/10 minutes par bain, puis application d'un solvant de la paraffine : toluène x2  étapes de réhydratation des coupes (les colorants sont incompatibles avec les milieux non aqueux) : bains d'alcools décroissants : 100° → 80° → 60° → 40° → 2x à 20° → eau x2  durée totale : plus d'une heure Des exemples de colorations :  mélange de 2 colorants : hématoxyline (base) + éosine (acide)  colorant basique attiré par les acides (ARN, ADN, ribosomes...) → coloration bleue  colorant acide attiré par les bases (cytoplasme) → coloration rouge/rose  coloration de Nissl :  coloration des tissus nerveux : ADN, ARN  crésyl violet : colore en violet  bleu de toluidine ou de méthylène : colorent en bleu  coloration des lipides :

 myéline dans le tissu nerveux ; comptage des nœuds de Ranvier  2 colorants possibles : noir soudan (noir) et oil red O (rouge)

 coloration de Golgi :  coloration par imprégnation argentique  marquage noir des axones et dendrites : idéal pour la morphométrie  fixation des tissus nerveux dans du bichromate de potassium  imprégnation par incubation dans du nitrate d'argent  l'immunohistochimie :  basée sur la reconnaissance antigène/anticorps  application de l'anticorps, 2 types possibles : ฀ polyclonaux : – solution d'anticorps différents, reconnaissent des sites différents sur un antigène – avantages : moins cher, augmente le nombre de réactions possibles entre antigène et anticorps – inconvénient : moins spécifique ฀ monoclonaux : – 1 seul type d'anticorps dans la solution qui reconnaît 1 site sur l'antigène – avantage : très haute spécificité – inconvénient : plus cher  révélation de la réaction : ฀ immunohistochimie directe : → – un traceur (chromophore, traceur fluorescent) qui permet la détection de la réaction antigène/anticorps – traceur fixé directement sur l'anticorps – un faible signal (antigène rare) peut ne pas être détecté ฀ immunohistochimie indirecte : 2 anticorps → – anticorps 2 ou secondaire : fixé au traceur → reconnaît l'anticorps 1 – anticorps 1 ou primaire : reconnaît l'antigène – spécificité améliorée mais pas d'amplification – un signal faible peut ne pas être détecté  complexes avidine-biotine (méthode ABC) = immunohistochimie indirecte avec amplification ฀ apport biotine + peroxydase ฀ apport avidine dans le milieu → reconnaissance avidine + biotine de l'anticorps secondaire ฀ anticorps secondaire biotinylé ฀ 1 avidine peut lier 4 biotines → système d'amplification ฀ technique basée sur l'affinité avidine/biotine ฀ quand il y a reconnaissance, rien ne peut les séparer : très forte affinité ฀ ajout d'avidine couplée à une enzyme ฀ apport du substrat de l'enzyme DAB ฀ précipité noir 2) Marquage des voies nerveuses. On va utiliser les moyens de transports des cellules nerveuses : antérograde (corps cellulaires → terminaisons nerveuses) & rétrograde (corps cellulaires ← terminaisons nerveuses).

Traceurs fluorescents :  très nombreux  couleurs très variées  migration rétrograde et/ou antérograde  traversent les synapses  vitesse de migration connue (ex : 6mm/jour rétrograde)  mixage possible → exemple : rouge (cytoplasme) + jaune (protéine cytoplasmique)

Inconvénients :  fading : épuisement de la coloration suite à l'éclairage (parfois en quelques heures), pour la conserver on peut faire une immunohistochimie (anticorps anti traceur fluorescent)  leaking : bavures de traceur lors de l'injection dans les tissus → marquage non désiré et non spécifique  nécrose : certains traceurs peuvent provoquer une nécrose cellulaire au point d'injection  on peut utiliser des billes fluorescentes : microbilles de latex avec un ou plusieurs fluorochromes → aucun des inconvénients, survie 12 semaines, mais ne traversent pas les synapses Horse Radish Peroxydase (HRP) :  enzyme extraite du radis noir  plusieurs formes disponibles : pure (HRP) ou HRP-WGA (Wheat Germ Agglutinin = lectine de blé → efficacité x20)  rétrograde, antérograde, trans-synaptique

 transport rapide 200-300 mm/jour (observation 1-2 jours après injection)  révélation après perfusion des tissus par glutaraldéhyde ou paraformaldéhyde (dangereux & toxiques) Acides aminés radioactifs :  moins utilisés actuellement : équipements lourds, autorisation, formation spécifique, locaux dédiés...  après injection sont absorbés facilement, et s'insèrent dans des protéines, transport antérograde  visualisation par autoradiographie Les toxines :  fragments inactifs (tétanos, botulisme)  transports rétrograde, antérograde, trans-synaptique  bonne survie (plusieurs semaines)  révélation par immunohistochimie Les virus :  herpès  transports rétrograde, antérograde, trans-synaptique : multiplication après chaque passage de synapse  vitesse de progression très rapide : 2-10 mm/h  injection possible (en très petite quantité) dans une muqueuse  marquage de la totalité du SN en 3-4 jours 3) La microscopie électronique et confocale. Microscopie électronique : 2 types :  transmission (MET) :  passage d'un faisceau d'électrons au travers d'une préparation  maintien du faisceau dans une colonne de vide : G x 300000 (limite : 1nm)  investissement lourd : climatisation, système de refroidissement, produits ultra-purs, coûteux  prix microscope : 200000-1000000 euros  balayage (MEB) :  faisceau d'électrons se déplace sur la coupe (balayage)  G x 300000 (limite : 10nm)  impression de 3D  coloration des images par ordinateur

Microscopie confocale :  microscope détecteur de traces fluorescentes qui pratique des coupes virtuelles par un laser dans un échantillon  tissus épais possibles : jusque 150µm  prise de cliché à chaque déplacement du laser dans l'échantillon (par exemple : 0,1µm dans les axes X, Y, Z)

    

reconstruction par ordinateur images en 3D colorisation possibilité de faire pivoter les reconstructions possibilité d'étudier des échantillons vivants

4) Le scanner (tomographie assistée par ordinateur). Également appelé tomodensitométrie. Principe : une source de rayon X mobile autour de la zone d'intérêt, prise de clichés ) chaque déplacement (tous les 1 mm). Patient allongé, immobile,c'est la source qui se déplace. Images en niveaux de gris en 2D : 1 niveau de gris = 1 consistance de tissu (plus le tissu est dense, plus ce sera foncé). Reconstruction par ordinateur en 3D, colorisation possible. Des agents de contraste injectés peuvent améliorer la visibilité.

Apports de cette technique :  non invasif  pas de chirurgie du patient  permet de suivre des tumeurs peu faciles d'accès (cérébrales) Mais technique coûteuse : 600000 euros minimum pour un scanner.

5) Angiographie. Scanner appliqué à l'observation des vaisseaux sanguins : photos aux rayons X. Amélioration par des agents contrastants. Recherche de points d'obstruction de vaisseaux sanguins : caillot, AVC, pose de stent...

6) Imagerie par Résonance Magnétique (IRM). Ou résonance magnétique nucléaire (RMN). Application de champs magnétiques à l'organisme : patient étendu dans un tunnel constitué d'aimants en anneau. C'est le patient qui pénètre dans le tunnel. Résolution 0,3mm, os non visibles : seulement les tissus mous. Images en niveaux de gris mais colorisation possible.

Avantages :  méthode non invasive, sans douleur  technique très précise  pas de préparation spéciale du patient Inconvénients :  très cher  technique très bruyante  espace restreint : le patient doit rester très calme et détendu → difficile pour les claustrophobes  déplacements possibles d'objets métalliques : plombages dentaires, broches, pace-maker...  effets inconnus des champs magnétiques sur l'organisme : absence de recul Les techniques d'imagerie sont aussi appliquées aux animaux de laboratoire. II- Techniques utilisées en anatomie fonctionnelle. But : associer à une structure (nerveuse) une tâche particulière : par exemple identifier une partie du cerveau et prouver qu'elle intervient dans une tâche.

1) Approche clinique. Visualiser les conséquences fonctionnelles de lésions. Chez l'Homme : observer les conséquences des lésions accidentelles. P. Gage :  accident sur un chantier  barre de fer qui est passé par les lobes frontaux  survie mais changement de personnalité Conclusion → les lobes frontaux interviennent dans le développement de la personnalité. Chez l'animal : induction de lésions expérimentales en laboratoire → destruction d'une zone nerveuse et observation du comportement de l'animal :  destruction par un courant électrique (électrode)  section de faisceaux nerveux  micro-aspiration  micro(injection de substances chimiques (souvent non réversibles)  refroidissement ciblé (liquide refroidissant ou substance chimique : lidocaïne) ; réversible 2) Tomographie à émission de positons. TEP-scan ou PET-scan.

Combinaison de 2 techniques : la TEP et le scanner. La TEP seule ne permet pas une localisation précise des cellules observées. C'est pourquoi, pour plus d'exactitude, il faut la combiner avec une autre forme d'imagerie qui permet de localiser ces cellules : le scanner.

Injection d'une substance radioactive (oxygène ou glucose) et détection par scanner. Passage du composé radioactif dans le sang et utilisation par les cellules actives :  permet de voir les zones en activité du cerveau lors de tâches particulières  permet de détecter l'état de conscience d'un individu Le composé radioactif en se dégradant émet un neutron et un positron (positon) = émission de rayons gamma recueillis par des capteurs. Images en niveaux de gris, puis colorisées. Résolution : 5mm (scanner classique : 1mm) mais permet de voir le cerveau en activité.

Personne saine vigile : consommation optimale du glucose. Personne saine endormie : consommation de glucose réduite de 40%, 50% si anesthésie.

Mort cérébrale : aucune consommation de glucose, sauf pour la peau du crâne. Plus la personne est consciente, plus la consommation est importante. Syndrome d'enfermement : impossible pour les patients de faire le moindre geste mais le cerveau est normal : lésion au niveau du tronc cérébral : point de la motricité. PET-Scan :  technique chère  utilisation de produits radioactifs → installations spécifiques, autorisations...  1 PET-Scan = 2,5 millions d'euros  installation = 800000 euros  fonctionnement = 2 millions d'euros par an Demie-vie des traceurs courte :  glucose radioactif (fluorodésoxyglucose 18F) : 110minutes (1 dose = 500 euros)  oxygène radioactif : 120 secondes  doivent être produits sur place, nécessite un accélérateur de particules Les PET-Scan sont donc rares : 59 en France (1/800000 habitants), 670 dans le monde. 3) Détection de l'expression des protéines précoces. Principe : des cellules actives vont produire des protéines venant de gènes d'expression précoce (cFos et CREB

le plus souvent car on a beaucoup d'anticorps pour ces protéines). Recherche de ces protéines dans certaines zones d'intérêt : par exemple les zones du cerveau après une activité particulière. Prélèvement des tissus, coupes et détection de la protéine par immunohistochimie : anticorps anti-protéine précoce. Détection de cFos sur une coupe de cerveau de rat : points noirs. Points noirs = présence de cFos → indique les cellules actives :

4) Consommation de déoxyglucose. Hypothèse : une cellule active consomme du glucose. Principe : injecter dans les tissus, dans la circulation sanguine du déoxyglucose (analogue du glucose, mais non dégradable). Accumulation donc dans les cellules actives → recherche du déoxyglucose dans les tissus d'intérêt. III- Techniques d'électrophysiologie. But : mesurer (enregistrer) l'activité du système nerveux. 1) Possibilités d'enregistrement.  extracellulaire →1 neurone (plus souvent plusieurs) : électrode déposée à proximité ou au contact du ou des neurones  intracellulaire → 1 cellule unique : électrode implantée dans le neurone (plus fine : mesure du potentiel de repos)  patch-clamp → 1 électrode (pipette de verre) implantée dans une cellule ; différentes configurations : enregistrement d'un canal ionique (du plus grossier au plus fin) L'enregistrement extracellulaire :

L'enregistrement intracellulaire : Insertion d'une microélectrode de verre : tube de verre étiré rempli d'un liquide conducteur.

Le patch-clamp : Approche d'une électrode (pipette de verre sur une cellule). Plusieurs configurations possibles : cellule entière à un canal ionique.

2) Les modes de stimulation. Implantation d'électrodes intracrâniennes, très fines (...