Techniques - technique d\'etude de la cellule PDF

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technique d'etude de la cellule...

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Chapitre /titre Chapitre : techniques Techniques d’étude de la cellule Objectif principal: connaître certaines techniques utilisées en histologie pour étudier des cellules ou des tissus

Coloration Techniques courantes Techniques spéciales Autoradiographie Histochimie enzymatique

General objectives :

Mots clefs

Coloration Techniques courantes La plupart des cellules et du matériel extracellulaire sont complètement incolores, et pour être étudiés au microscope, les coupes de tissus doivent être colorées. Des méthodes

de

conçues

pour

coloration rendre

ont

été

divers

composants tissulaires, non seulement visibles mais également distincts les uns des autres. Un marquage c’est une molécule qui peut se lier à une structure cellulaire et lui donner de la couleur, ce qui la rend plus facile à voir. Dans certains cas, les différentes techniques de coloration

L'hématoxyline et l'éosine sont les colorants de laboratoire les plus courants L'hématoxyline est un colorant bleu / violet; l'éosine est rouge Dans cet épithélium, la chromatine nucléaire, riche en acide nucleique et est donc attirée par le colorant bleu, il est basophile. le cytoplasme, avec ses différents organites, est coloré en rouge (éosinophile). Le cytoplasme est dit acidophile.

sont plus ou moins sélectives, se comportant souvent comme des composés acides ou basiques et formant des liaisons électrostatiques avec des radicaux ionisables de macromolécules dans les tissus. Les composants cellulaires tels que les acides nucléiques avec une charge négative nette (anionique) ont une affinité pour les colorants basiques et sont appelés basophiles; les composants cationiques, tels que les protéines avec de nombreux groupements amines ionisés, se colorent plus facilement avec les colorants acides et sont appelés acidophiles. Des exemples de colorants basiques comprennent le bleu de toluidine, le bleu alcian et le bleu de méthylène. L'hématoxyline se comporte comme un colorant basique, qui se fixe sur les structures basophiles des tissus. Les principaux composants tissulaires qui s'ionisent et réagissent avec les colorants basiques le font en raison

des acides dans leur composition (ADN, ARN et glycosaminoglycanes). Les colorants acides (par exemple l'éosine, l'orange G et la fuchsine acide) colorent les composants acidophiles des tissus tels que les mitochondries, les granules sécrétoires et le collagène. De toutes les méthodes de coloration, la combinaison entre hématoxyline et éosine (H&E) est la plus utilisée. L'hématoxyline colore l'ADN du noyau en produisant une couleur bleu foncé. En revanche, l'éosine colore d'autres structures cytoplasmiques (rouge). Ici, l'éosine est considérée comme une contre-coloration, qui est généralement un

colorant

unique

appliqué

séparément

pour

distinguer

les

caractéristiques

supplémentaires des tissus. Des procédures plus complexes, telles que la coloration au trichrome (par exemple, le trichrome de Masson), permettent de plus grandes distinctions entre les divers composants des tissus extracellulaires. Techniques spéciales ■ L’Acide Périodique de Shiff (PAS) est une technique de coloration spéciale utilisée pour détecter les polysaccharides (comme le glycogène, les glycoprotéines, les glycolipides et la mucine dans les tissus) qui ne sont pas colorés par des techniques courantes (HE).

Micrographies de l'épithélium tapissant l'intestin grêle, colorées avec H&E, les noyaux basophiles des cellules sont colorés en violet et le cytoplasme se colore en rose. Les cellules dont le pôle apical est riche en mucus, sont peu colorées. Ce sont les cellules caliciformes

Micrographies d'épithélium tapissant l'intestin grêle, colorées avec la réaction PAS pour les glycoprotéines Avec le PAS, la coloration cellulaire est la plus intense dans les granules sécrétoires riches en mucine des cellules caliciformes (en rouge). Les glycoprotéines de surface cellulaire et la mucine sont PAS positives en raison de leur teneur élevée en oligosaccharides et en polysaccharides respectivement.

■ Les structures cellulaires riches en lipides sont révélées en évitant les étapes de traitement qui éliminent les lipides, telles que le traitement avec de la chaleur et des solvants organiques, et la coloration avec des colorants liposolubles tels que le noir de Soudan, qui peuvent être utiles dans le diagnostic des maladies métaboliques impliquant des intracellulaires accumulations de cholestérol, de phospholipides ou de glycolipides. Autoradiographie L'autoradiographie microscopique est une méthode de localisation de macromolécules nouvellement synthétisées dans des cellules ou des coupes

de

tissus.

Les

métabolites

marqués

par

radioactivité (nucléotides, acides aminés, sucres) fournis aux

cellules

vivantes

macromolécules

sont

spécifiques

incorporés (ADN,

ARN,

dans

des

protéines,

glycoprotéines et polysaccharides) et émettent un faible rayonnement qui est limité aux régions où se trouvent les molécules.

Les

échantillons

avec

des cellules

radio

marquées ou des coupes de tissus sont enduites dans une chambre noire d'émulsion photographique dans laquelle les

cristaux

de

bromure

d'argent

agissent

comme

microdétecteurs du rayonnement de la même manière qu'ils réagissent à la lumière du film photographique. Les cristaux de bromure d'argent réduits par le rayonnement produisent de petits grains noirs d'argent métallique qui, au microscope optique ou au TEM, indiquent l'emplacement des macromolécules radio marquées dans le tissu. Application: De nombreuses informations histologiques deviennent disponibles par autoradiographie. Si un précurseur radioactif d'ADN (comme la thymidine marquée au tritium) est utilisé, il est possible de savoir quelles cellules d'un tissu (et combien) répliquent l'ADN et se préparent à se diviser. Les événements dynamiques peuvent également être analysés. Par exemple, si l'on souhaite savoir où, dans la cellule la protéine est produite, si elle est sécrétée et quelle est son chemin dans la cellule avant d'être sécrétée, pour cela plusieurs animaux sont injectés avec des acides aminés radioactifs et les tissus

sont prélevés à différents moments après les injections. L'autoradiographie des tissus réalisée à différents moments après l’injection indiquera la cinétique des protéines radioactives. Histochimie enzymatique L'histochimie enzymatique (ou cytochimie) est une méthode de localisation des structures cellulaires utilisant une activité enzymatique spécifique présente dans ces structures. Dans ce cas, les enzymes doivent être préservées de la détérioration due à la chaleur et aux solvants organiques. Pour l'histochimie enzymatique, les coupes de tissus sont immergées dans une solution contenant le substrat (S) de l'enzyme (E) à localiser. L'enzyme va agir sur son substrat et la coupe histologique est ensuite mise en contact avec un composé marqueur (M) qui réagit avec le produit de l'action enzymatique sur le substrat (P); et le produit final (FP) du marqueur, qui doit être insoluble et visible par microscopie optique ou électronique après avoir précipité sur le site des enzymes, identifiant leur emplacement. S+E=P P + M = FP insoluble et visible, donc la localisation est possible. Ci-dessous, quelques exemples d'enzymes pouvant être détectées histochimiquement : ■Phosphatases, qui éliminent les groupes phosphates des macromolécules. E= phosphatase

S= esters phosphoriques de glycérol S+E= sel métallique (P)

PF= sulfure de plomb ■Deshydrogenases : elles transfèrent les ions hydrogène d'un substrat à un autre, comme de nombreuses enzymes du cycle de l'acide citrique (Krebs), permettant l'identification histochimique de ces enzymes dans les mitochondries. ■Péroxidases, elles favorise l'oxydation de substrats par le transfert des ions hydrogène en formant le peroxyde d'hydrogène. Immunohistochimie Elle repose sur une interaction très spécifique entre les macromolécules, c’est celle qui se produit entre un antigène et son anticorps. Pour cette raison, les anticorps marqués sont couramment utilisés en immunohistochimie pour identifier et localiser de nombreuses protéines spécifiques. Les cellules immunitaires du corps interagissent et produisent des anticorps contre d’autres macromolécules, appelées antigènes, qui sont reconnues comme «étrangères»

et potentiellement dangereuses. Les anticorps appartiennent à la famille des immunoglobulines des glycoprotéines et sont sécrétés par les lymphocytes. Ces molécules

se

spécifiquement

lient à

normalement

leurs

antigènes

contribuant à leur élimination. Largement appliquée à la fois à des fins de recherche et de diagnostic, toute technique

immunohistochimique

nécessite un anticorps contre la protéine à détecter. Pour produire des anticorps contre la protéine x d'une certaine espèce

animale

(par

exemple,

un

humain ou un rat), la protéine isolée est injectée à un animal d'une autre espèce (par exemple, un lapin ou une chèvre). Si la séquence d’acides aminés de la protéine est suffisamment

différente

pour

que

cet

animal

la

reconnaisse comme étrangère, c’est-à-dire comme antigène, l’animal produira des anticorps contre la protéine. Ces anticorps sont collectés à partir du plasma de l’animal et constituent un mélange d’anticorps polyclonaux, capables de se lier à la protéine x. En immunohistochimie, une coupe de tissu dont on pense qu'elle contient la protéine d'intérêt est incubée dans une solution contenant un anticorps contre cette protéine. L'anticorps se lie spécifiquement à la protéine et après un rinçage, l'emplacement de la protéine dans le tissu ou les cellules peut être vu au microscope en visualisant l'anticorps. Les anticorps sont généralement marqués avec un composé fluorescent (étiquette fluorescente dans le diagramme) et observés sous microscopie à fluorescence (ou microscope UV). C'est l'immunofluorescence Quelques exemples à importance diagnostic antigène

diagnostic

Cytokératine Specifique

Tumeurs d’origine épithéliale

Protéines et hormone polypeptidiques Certaines tumeurs endocrines Antigène carcino embryonnaire

Tumeurs glandulaires

Récepteur d’hormones stéroïdes

Tumeur du canal mammaire

Antigène produit par un virus

Infection viral spécifique

Dans la méthode de GOMORI par exemple, pour la détection de la phosphatase alcaline on utilise comme substrat les esters phosphoriques de glycérol. L’ion phosphate libéré p, par hydrolyse est d’abord précipité sous forme d’un sel métallique insoluble. Le sel ainsi formé est ensuite visualisé par transformation en argent métallique, en sulfure de plomb, en sulfure de cobalt ou autres composé colorés. Par une autre méthode, on utilise comme substrat un ester phosphorique de β -naphtol. Le βnaphtol libéré par hydrolyse enzymatique est visualisé par un couplage immédiat ave un sel de diazonium qui donne naissance à un colorant diazoïque au site même de l’activité de l’enzyme. Cette méthode, avec des conditions d’incubations et des substrats appropriés permet de mettre en évidence d’autres enzymes hydrolytiques comme l’estérase, la lipase, la phosphatase acide, la sulfatase Les déshydrogénases liées à des nucléotides pyridiniquyes requièrent les coenzymes NAD+ et NADP+. Parmi les plus connues des enzymes à NAD+, mentionnant la déshydrogénase de l’acide lactique en acide pyruvique et la désohydrogénanse de l’acide malique qui transforme l’acide malique en acide oxaloacétique. Les oxydases sont des enzymes qui catalysent la transfert des électrons d’un substrat donneur à l’oxygène. Elles contiennent du fer (peroxydase et catalase) ou du cuivre (tyrosinase et polyphénol oxydase)

A retenir

Lien avec la clinique /pathologie

Points clefs Résumé...