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COMUNICAZIONE TRA CELLULE Le cellule hanno un destino preciso durante lo sviluppo. Quali processi influenzano il destino cellulare ? → induzione e competenza L’induzione è un fenomeno che prevede almeno due componenti : • Inducer : cellule che emettono un segnale • Responder : cellule che rispondono al segnale • Competenza : capacità di una cellula avvertire/rispondere ad un segnale induttivo La cellula deve essere in grado di rispondere al segnale induttivo (competenza). • Presenza del recettore specifico. • Presenza del meccanismo di trasduzione del segnale. • Presenza di fattori di trascrizione che possano attivare i geni specifici. Ogni cellula, a seconda del suo stato di differenziamento, possiede uno specifico set di recettori per rispondere ai segnali che sono necessari per le sue funzioni. L'interazione tra le molecole segnale ed i loro recettori determina cambiamenti conformazionali del recettore. Il legame è reversibile Come avviene la trasmissione dei segnali dall’induttore alla struttura competente ? Interazioni iuxtacrine : quando proteine di membrana della superficie cellulare interagiscono con proteine recettrici della superficie di cellule adiacenti. Interazioni paracrine : quando proteine sintetizzate da una cellula possono diffondere per brevi distanze inducendo modificazioni nelle cellule vicine. Mentre i fattori endocrini (ormoni) circolano nel sangue per esercitare la loro azione, i fattori paracrini vengono secreti nello spazio immediatamente circostante le cellule che li producono. Oltre alle interazioni endocrine, paracrine e iuxtacrine esiste anche un’interazione autocrina. Questa ha luogo quando le stesse cellule che secernono fattori paracrini sono anche capaci di rispondere loro. In altre parole la cellula sintetizza una molecola per la quale possiede anche un proprio recettore.

FATTORI PARACRINI : LE MOLECOLE INDUTTRICI L’induzione di numerosi organi è effettivamente operata da una serie relativamente piccola di fattori paracrini. l’embrione eredita una “cassetta degli attrezzi” genetica piuttosto piccola e usa molte delle stesse proteine per costruire il cuore, i reni, i denti, gli occhi e altri organi. Le stesse proteine sono utilizzate in tutto il regno animale. Molti di questi fattori paracrini possono essere raggruppati in base alla loro struttura in una delle quattro famiglie principali : ✔ La famiglia dei fattori di crescita dei fibroblasti (FGF) ✔ La famiglia Hedgehog ✔ La famiglia Wnt ✔ La superfamiglia TGF-b che comprende la famiglia TGF-b , la famiglia dell’activina, le proteine morfogenetiche dell’osso, le proteine Nodal, la famiglia Vg1 e molte altre proteine correlate. I fattori paracrini agiscono legandosi a un recettore che dà il via a una serie di reazioni enzimatiche nella cellula. Queste reazioni enzimatiche hanno come punto di arrivo la regolazione di fattori di trascrizione, oppure la regolazione del citoscheletro. Questi percorsi di risposta al fattore paracrino hanno spesso diversi punti di arrivo e sono definiti cascate di trasduzione del segnale. Ciascun recettore si estende attraverso la membrana cellulare e possiede una regione extracellulare, una regione transmembrana e una regione citoplasmatica. Quando un ligando (in questo caso un fattore

paracrino) si lega al dominio extracellulare del suo recettore, induce una modificazione conformaizonale della struttura del recettore. Questo cambio di forma viene tramesso attraverso la membrana e altera la forma dei domini citoplasmatici del recettore. Tale modifica conformazionale dei domini citoplasmatici conferisce loro attività enzimatica, solitamente un’attività chinasica che può usare ATP per fosforilare specifici residui di tirosina di particolari proteine. Per questo motivo, un simile tipo di recettore viene spesso definito tirosin chinasi recettoriale. Il recettore così attivato può quindi catalizzare reazioni che fosforilano altre proteine; questa fosforilazione può a sua volta attivare le loro funzioni latenti. In ultimo la cascata di fosforilazioni giunge ad attivare un fattore di trascrizione sino ad allora silente, oppure un sistema di proteine citoscheletriche.

I fattori di crescita dei fibroblasti (FGF) e la via di trasduzione del segnale RTK La famiglia di fattori paracrini dei fattori di crescita dei fibroblasti (fibroblast growth factors, FGF) comprende circa due dozzine di membri strutturalmente correlati, e i geni FGF possono generare centinnaia di isoforme proteiche variando il loro splicing dell’RNA o i codoni di inizio di in diversi tessuti. Gli FGF agiscono spesso attivando un gruppo di tirosin chinasi recettoriali chiamate recettori dei fattori di crescita dei fibroblasti (growth factor receptors, FGFR). Quando un FGFR lega un FGF (e solo a questa condizione), il suo dominio chinasico quiescente viene risvegliato e può fosforilare determinate proteine (inclusi altri FGFR) all’interno della cellula rispondente. Queste proteine, una volta attivate, possono svolgere nuove funzioni. La via di trasduzione del segnale RTK fu una delle prime vie di questo tipo a mettere in collegamento fra loro varie aree della biologia dello sviluppo. La via RTK ha inizio a livello della superficie della cellula, dove un RTK lega il suo specifico ligando. Fra i ligandi che si legano agli RTK, sono compresi i fattori di crescita dei fibroblasti, i fattori di crescita dell’epidermide, i fattori di crescita derivati dalle piastrine e il fattore delle cellule staminali. Ogni RTK può legare soltanto uno, o una piccola serie, di questi ligandi. Ogni RTK si estende attraverso la membrana cellulare e, quando si unisce al suo ligando, va incontro a modificazioni strutturali che gli consentono di formare un dimero con un altro RTK. Tale modifica conformazionale stimola l’attività chinasica latente presente in ciascun RTK e questi recettori attuano ciascuno la fosforilazione di particolari residui di tirosina sull’altro. Quindi, l’unione del ligando al recettore provoca l’auto(trans)fosforilazione del dominio citoplasmatico del recettore (questo processo è necessario per attivare il recettore). La tirosina fosforilata del recettore viene allora riconosciuta da una proteina adattatrice. Questa serve come ponte, unendo l’RTK fosforilato a un potente sistema di segnalazione intracellulare. Mentre si lega all’RTK fosforilato mediante uno dei suoi domini citoplasmatici, la proteina adattatrice attiva anche una proteina G nota come Ras. Normalmente la proteina G è in uno stato inattivo, legata a GDP. Il recettore attivato stimola la proteina adattatrice ad attivare il fattore di rilascio del nucleotide guanina (guanine nucleotide releasing protein, GNRP). Questa proteina trasferisce un fosfato dal GTP al GDP legato che diviene GTP. La proteina G legata a GTP è nella sua forma attiva, in grado di trasmettere il segnale alla molecola successiva. Dopo la trasmissione del segnale, il GTP legato alla proteina G viene di nuovo idrolizzato a GDP. Questa attività catalitica è fortemente stimolata dalla formazione di un complesso della proteina Ras con la proteina che attiva la GTPasi (GTP-ase-activating protein, GAP). In questo modo, la proteina G ritorna al suo stato inattivo nel quale può attendere un altro segnale. Senza la proteina GAP, la proteina RAS non può idrolizzare bene il GTP e così rimane nella sua conformazione attiva. La proteina G Ras attiva si associa alla chinasi Raf. La proteina G recluta la proteina Raf inattiva indirizzandola alla membrana cellulare, dove viene attivata. La proteina Raf è una chinasi che attiva, mediante fosforilazione, la proteina MEK. Anche MEK è una chinasi, che attiva, fosforilandola, la proteina ERK. ERK è a sua volta una chinasi, che entra nel nucleo e attua la fosforilazione di determinati fattori di trascrizione. La via ERK ha un ruolo cruciale in numerosi processi dello sviluppo. Inoltre, può essere attivata da altri fattori paracrini, diversi da quelli della famiglia FGF.

Quali proteine segnalano a questo fattore di trascrizione di divenire attivo? La chiave sta in due topi mutanti, il cui fenotipo assomiglia a quello di topi omozigoti per mutazioni di microphtalmia. Come i topi mutanti per Mitf, i topi omozigoti per White e quelli per Steel sono bianchi, perché le loro cellule produttrici di pigmento non sono migrate. È lecito ipotizzare che tutti e tre i geni (Milf, Steel, White) si trovino sullo stesso percorso metabolico importante per lo sviluppo? Nel 1990, in diversi laboratori fu dimostrato che il gene Steel codifica un fattore paracrino chiamato fattore delle cellule staminali. Il fattore delle cellule staminali si lega, attivandola, alla tirosin chinasi recettoriale Kit, codificata dal gene White. Il legame del fattore delle cellule staminali all’RTK Kit consente la dimerizzazione della proteina Kit determinandone la fosforilazione. Kit fosforilata attiva la via nella quale ERK fosforilata è in grado di fosforilare il fattore di trascrizione MITF. (Possono verificarsi mutazioni a livello di Kit  si verificano problemi a livello della pigmentazione, sterilità, problemi di peristalsi intestinale).

La via JAK-STAT I fattori di crescita dei fibroblasti sono anche in grado di attivare la cascata JAK-STAT. Questa via di trasduzione del segnale è di estrema importanza per il differenziamento delle cellule del sangue, per la crescita degli arti e per l’attivazione del gene della caseina nella produzione del latte. In questo caso il ligando viene legato da recettori associati stabilmente alle proteine JAK (chinasi Janus) → il recettore per essere funzionante deve dimerizzare. Il legame del ligando al recettore consente la fosforilazione della famiglia di fattori di trascrizione STAT. La via STAT è molto importante nella regolazione dell’accrescimento delle ossa fetali nell’uomo. Mutazioni che

attivano prematuramente la via STAT sono implicate in alcune gravi forme di nanismo, come la displasia tanatofora, letale, nella quale le cartilagini di accrescimento delle cose e delle ossa degli arti cessano di proliferare. Il neonato che presenta brevità degli arti, muore perché le sue coste non sono in grado di sostenere la respirazione. L’anomalia genetica responsabile di questa forma interessa il gana codificante il recettore del fattore di crescita dei fibroblasti (FgfR3). Questa proteina è espressa nei precursori delle cellule della cartilagine, noti come condrociti, delle piastre di accrescimento delle ossa lunghe. Normalmente la proteina FgfR3 (una tirosin chinasi recettoriale) è attivata da un fattore di crescita dei fibroblasti e segnala ai condrociti di cessare di dividersi e di iniziare il differenziamento della cartilagine. Questo segnale è mediato dalla proteina Stat1, che viene fosforilata dall’FgfR3 attivato ed è poi trasferita nel nucleo. All’interno del nucleo Stat1 attiva i geni che codificano un inibitore del ciclo cellulare, la proteina p21. La mutazione che causano il nanismo tanatoforo danno come risultato un fenotipo di acquisizione di funzione, in cui l’FgfR3 mutante è costitutivamente attivo, cioè è attivo senza che sia necessario il legame di un Fgf. Questo fa sì che i condrociti smettano di proliferare subito dopo che si sono formati, e le ossa non si accrescano. Mutazioni che attivano prematuramente l’FgfR3 in misura più lieve provocano il nanismo acondroplastico (con brevità degli arti), la più frequente sindrome dominante nell’uomo. Per quanto riguarda i cani di razza bassotto quello che è permanentemente attivo è il ligando (viene continuamente prodotto). Le zampe diventano più corte. Questa mutazione è stata selezionata per ottenere questa razza.

Famiglia di proteine Hedgehog Le proteine della famiglia, di fattori paracrini Hedgehog sono spesso utilizzate dall’embrione per indurre particolari tipi cellulari e creare confini tra i tessuti. I vertebrati possiedono almeno tre omologhi del gene hedgehog di Drosophila : sonic hedgehog (shh), desert hedgehog (dhh), e indian hedgehog (ihh). La proteina Desert hedgehog è espressa nelle cellule di Sertoli dei testicoli. La proteina Indian hedgehog è espressa nel tratto digerente e nella cartilagine ed è importante nell’accrescimento postnatale dell’osso. Sonic hedgehog possiede il numero più alto di funzioni tra i tre omologhi di Hedgehog nei vertebrati. Questo fattore paracrino assicura, fra l’altro, che i neuroni motori fuoriescano solo dalla porzione ventrale del tubo neurale, che una porzione di ogni somite formi le vertebre, che le penne del pollo si formino al posto giusto, e che i nostri mignoli siano sempre le nostre dita più posteriori. Sonic hedgehog agisce spesso insieme ad altri fattori paracrini, quali Wnt e FGF.

La via Hedgehog Le proteine della famiglia Hedgehog agiscono legando un recettore chiamato Patched. La proteina Patched, però, non è un trasduttore del segnale; è invece legata a un trasduttore del segnale, la proteina Smoothened. La proteina Patched impedisce alla proteina Smoothened di funzionare. In assenza del legame di Hedgehog a Patched, Smoothened è inattiva e la proteina Cubitus interruptus (Ci) o la sua omologa Gli nei vertebrati, è legata ai microtubuli della cellula che attua la risposta. Quando viene unita ai microtubuli, Ci è scissa in modo tale che una parte di essa entri nel nucleo e agisca come repressore della trascrizione. Quando Hedgehog si lega a Patched, la forma di quest’ultima si modifica in modo tale da non inibire più Smoothened. Questa agisce come attivatore degli stessi geni che solitamente reprime. La via Hedgehog è estremamente importante nello sviluppo degli arti, nel differenziamento neurale e nella morofogenesi facciale dei vertebrati. Quando furono generati topi omozigoti per un allele mutante di sonic hedgehog, questi presentavano importanti anomalie degli arti e della morfologia facciale. La linea mediana del capo era gravemente ridotta e un singolo occhio si formava nel centro della fronte, una condizione nota come ciclopia . Nelle fasi successive dello sviluppo, Sonic Hedgehog è molto importante per la formazione delle penne nell’embrione di pollo e nella formazione dei peli dei mammiferi. Mentre le mutazioni che inattivano la via Hedgehog possono causare malformazioni, le mutazioni che attivano la via in sedi improprie (ectopiche) possono causare tumori. La proteina Patched, se in alcuni tessuti dell’organismo è mutata in modo tale da non inibire più Smoothened, può provocare neoplasie delle cellule dello strato basale dell’epidermide (carcinomi basocellulari). Mutazioni ereditarie del gene patched causano la sindrome del nevo basocellulare, una rara condizione autosomica dominante, caratterizzata sia sia da anomalie di sviluppo, sia da tumori maligni mulitpli come i carcinomi basocellulari. Una caratteristica sorprendente della via di trasduzione del segnale Hedgehog è l’importanza del colesterolo. In primo luogo il colesterolo è importante per il taglio catalitico della proteina Sony Hedgehog . Soltanto la porzione ammino-terminale della proteina è funzionale e viene secreta. Il colesterolo si lega inoltre all’estremità ammino-terminale attiva di Sonic Hedgehog permettendo a questo fattore paracrino di diffondersi per un raggio di alcune centinaia di mm. Senza questa modificazione del colesterolo la molecola si diffonde troppo velocemente e si disperde, ma sono connesse mediante le loro regioni ricche di colesterolo per formare blocchetti lipoproteici. In secondo luogo anche la proteina Patched, che lega Sony Hedgehog, ha bisogno del colesterolo per funzionare. Alcuni sindromi fra le quali la ciclopia nell’uomo, sono causate da mutazioni di geni che codificano Sonic hedgehog o gli enzimi che sintetizzano il colesterolo. Inoltre, certe sostanze chimiche che inducono la ciclopia agiscono interferendo con gli enzimi della biosintesi del colesterolo. Due agemti teratogeni noti come causa di ciclopia nei vertebrati sono la jervina e la ciclopamina.

Il capo di un agnello affetto da ciclopia nato da una pecora che aveva brucato le foglie di Veratrum caifornicum durante le prime fasi della gravidanza. Gli emisferi cerebrali appaiono fusi determinando la formazione di un singolo occhio centrale e l’assenza dell’ipofisi. L’alcaloide noto come jervina prodotta da questa pianta inibisce la sintesi del colesterolo necessario per la produzione e la ricezione del segnale Hedgehog.

Famiglia Wnt Le proteine Wnt costituiscono una famiglia di glicoproteine ricche di cisteina. Esistono almeno 15 membri di questa famiglia genica nei vertebrati. Mentre Sony Hedgehog è importante nel modellare la porzione ventrale dei somiti (inducendo le cellule a divenire cartilagine), Wnt1 sembra sia attiva nell’indurre le cellule dorsali del somite a divenire muscolo ed è coinvolta nella specificazione delle cellule della porzione media

dell’encefalo. Le proteine Wnt sono cruciali anche nello stabilirsi della polarità degli arti di insetti e vertebrati, promuovendo la proliferazione delle cellule staminali, e in diverse fasi dello sviluppo del sistema urogenitale. Le proteine Wnt furono isolate nella loro forma attiva solo nel 2003. In quell’anno Wnt, Willert e collaboratori scoprirono che ogni proteina Wnt possiede una molecola lipidica covalentemente legata a sé. Tali molecole idrofobiche sono fondamentali per l’attività delle proteine Wnt e agiscono probabilmente aumentando la loro concentrazione sulla membrana cellulare. La via Wnt canonica La proteina Wnt si lega al suo recettore, un membro della famiglia di proteine Frizzled. Nel caso di certe proteine Wnt, la proteina Frizzled attiva poi Disheveled consentendole di divenire un inibitore della glicogenosintetasi chinasi 3 (GSK3). Se fosse attiva, GSK3 impedirebbe la dissociazione della b-catenina dalla proteina APC. In tal modo, inibendo GSK3, il segnale Wnt libera in realtà la b-catenina, permettendone l’associazione con una proteina LEF o TCF e la sua trasformazione in un fattore di trascrizione attivo. Un principio facilmente osservabile sia nella via Wnt che in quella Hedgehog è che l’attivazione è spesso ottenuta inibendo un inibitore. Così, nella via Wnt, la proteina GSK3 è un inibitore a sua volta represso dal segnale Wnt.

! Se voglio capire se in un tessuto il segnale è attivo posso fare un immunoistochimica per la betacatenina. Se si trova nel citoplasma non è attiva, è attiva solo nel nucleo.

La superfamiglia TGF–b La superfamiglia TGF-b comprende oltre 30 membri strutturalmente correlati che regolano alcune delle più importanti interazioni dello sviluppo. Le proteine codificate dai geni della superfamiglia TGF-b sono rielaborate in modo che il peptide maturo sia contenuto nella regione carbossi-terminale. Questi peptidi si uniscono per formare dimeri – omodimeri o eterodimeri – e vengono secreti dalla cellula. La superfamiglia TGF- b comprende la famiglia TGF- b , la famiglia dell’activina, le proteine morfogenetiche dell’osso (BMP), la famiglia Vg1 e altre proteine, tra cui il fattore neurotrofico derivato dalla glia (GNDF) e il fattore inibitore dei dotti di Muller. I ligandi della superfamiglia TGF-b b operano come ormoni o mediatori locali per un grandissimo numero di funzioni biologiche sia nell’organismo adulto che durante lo sviluppo. Influenzano la proliferazione, il differenziamento e la morte cellulare. I componenti TGF-b1, 2, 3 e 5 della famiglia TGF-b sono importanti nel regolare la formazione della matrice extracellulare nello spazio fra le cellule e nel controllo (sia positivo che negativo) della divisione cellulare. Le proteine TGF-b possono essere importanti per la regolazione nello spazio e nel tempo della ramificazione degli epiteli in strutture tubulari del rene, nel polmone, nelle ghiandole salivari.

Le proteine della famiglia BMP possono essere distinte dagli altri membri della superfamiglia TGF-b dal fatto che possiedono sette (anziché nove) cisteine conservate lungo il polipeptide maturo. Poichè furono inizialmente scoperte grazie alla loro capacità di indurre la formazione delle ossa, furono chiamate proteine morfogenetiche dell’osso.. La formazione dell’osso, tuttavia, è soltanto una delle loro numerose funzioni; le BMP sono, infatti, estremamente multifunzionali. Si è osservato che regolano la divisione cellulare, l’apoptosi (morte cellulare programmata), la migrazione cellulare, il differenziam...