Técnicas para el estudio y manejo de bacterias PDF

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Si el genotipo ya cambia, es un cambio estable, un cambio heredable, tenemos ya una mutación. Y entonces tenemos una adaptación estable, heredable por mutación, bien por transferencia de genes o a través de un agente mutágeno que te hace mutar en unas condiciones específicas. Recordar que no todas las mutaciones son buenas.

TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO Y MANEJO DE BACTERIA -El estudio de las bacterias requiere: .. Aislar una sola especie de bacteria de las otras. Tenemos que llevar a cabo la separación de población. .. Asegurarse de que continuamos trabajando con la especie deseada (ejemplo, no introducir contaminantes). -Técnicas usadas para realizar esto se llaman técnicas asépticas (trabajar en ausencia de microorganismos, excepto los que queremos). Ejemplos: .. Esterilizar equipos (calor, compuestos químicos…). Estéril es ausencia de microorganismos con capacidad de reproducirse. Si hay células pero están muertas, pues es igual un medio estéril. Normalmente la metodología más utilizada es el calor seco, pero también hay el calor húmedo, que no hace falta tanta temperatura. Si el material se deforma por el plástico haremos servir otros métodos (son materiales termolábiles) con métodos gaseosos o radiaciones gamma. Tenemos tubos o placas de Petri, son materiales que se utilizan que ya están estériles. Herramientas para manejar el cultivo: hilo de siembra, asa de Kole, espátula de Digralsky. .. Evitar fuentes de contaminación: bacterias de manos, cara…, las bacterias que hay en el polvo, equipo no estéril. .. Conocimiento del ambiente de trabajo.

DEFINICIONES -Estéril: ausencia de microorganismos vivos. -Cultivo mixto: población de bacterias constituido por más de una especie. -Cultivo puro o axénico: población de bacterias constituida por una sola especie. De hecho un cultivo puro hace más referencia a una pureza genética, pero de manera coloquial se utilizan como sinónimos. -Subcultivo. Es sencillamente pasar de un cultivo que ya tenemos a otro medio de cultivo. -Inóculo: alícuota de una población que se introduce en un medio de cultivo para subcultivar. -Sembrar o inocular: acción de introducir un inóculo. -Incubar: proporcionar las condiciones ambientales adecuadas (temperatura, aireación, humedad, luz…). Es el último paso, lo hacemos una vez que hayamos inoculado. CEPAS SALVAJES Y BURGUESAS No es lo mismo un microbio que tiene la competencia de los microbios que viven o conviven en un ecosistema que el que cultivamos nosotros en el laboratorio. Entonces el microbio tiene que adaptarse y va a triunfar el que esté mejor adaptado. Un microbio en la cepa salvaje va a ser mucho más resistente y más versátil. La cepa del laboratorio es burguesa porque se le da de todo al microbio, y hace que estas cepas burguesas son mucho más sensibles, y son menos resistentes a las condiciones ambientales.

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AISLAMIENTO DE UN CULTIVO PURO El cultivo mixto lo pasamos a un medio de cultivo de laboratorio con un matraz Erlenmeyer y ponemos unas condiciones que permitan el aislamiento. Entonces el que queremos lo sembramos en un medio de cultivo, y lo que nosotros veremos será una colonia, que no es más que un montículo, un cúmulo de células de la misma especie que proceden de una sola célula (se dividen por división binaria). De hecho, nos servirá para contar el número de células que tenemos de una manera visible al principio. 3 células nos han generado 3 colonias por ejemplo. Ahora en las colonias se hacen pruebas metabólicas para saber quién es y cómo es. Y finalmente nosotros lo conservamos y aislamos en un tubo, con su nombre. TÉCNICAS BÁSICAS PARA OBTENER UN CULTIVO PURO DE UNO MIXTO, ES DECIR DE UN ECOSISTEMA. -Cogemos una alícuota del ecosistema y haremos la siembra. -Técnicas asépticas. -El asa de Kole, que es una aleación (el material, hay de platino pero son muy caras). Y las propiedades que tiene es que el hilo se pone incandescente con mucha facilidad a la llama. Con lo cual estamos matando todos los microorganismos que hay por aquí, y así esterilizamos la herramienta que utilizaremos para sembrar. Tiene un lacito en la punta que nos va muy bien cuando hay un medio líquido, porque ahí se forma como una especie de velo, que nos lo permite coger. Este sistema de siembra se suele utilizar cuando queremos pasar de una placa de Petri (medio sólido-sólido, líquido-líquido…. Se hacen siembras tipos estrías. -Hilo de siembra o aguja, es igual que el anterior pero no tiene el bucle, el anillo del final. Y con este se utiliza para hacer siembras en picadura. -Espátula de Digralsky, es de vidrio y en la punta hay un triángulo. Si esto lo ponemos directamente a la llama del mechero se romperá. Entonces lo que hay que hacer para esterilizarlo es mojarlo en alcohol y acercarlo a la llama durante muy poco tiempo. Con esto se siembra por extensión.

-Esterilización a la llama y transferencia de tubo. -Lo ponemos suficientemente inclinado para que se pase el fuego pero no tanto para que te queme la mano. -Tenemos un mechero que esteriliza. Cuando nosotros ponemos un asa con un cultivo aquí se desprenden aerosoles o partículas que nos pueden contaminar. Entonces aquí, no se producen estos aerosoles, que en las técnicas asépticas sí que ocurre. -También tenemos un incinerador como mechero. -Preparando un medio. Su elección. -Siembra por estrías en placas. -Siembra en placa por dilución. -Siembra en placa por inclusión (vertido). -Siembra en placa por inundación. MEDIO DE CULTIVO -Es una fuente de nutrientes necesarios para el crecimiento de las bacterias. Deberá contener todos los nutrientes esenciales: agua, fuente de nitrógeno, S, P y micronutrientes (hierro, magnesio... que son imprescindible pero en menor cantidad y oligoelementos que aún van en menos cantidad que los micronutrientes como el manganeso), fuente de energía y fuente de carbono (orgánico o inorgánico). 8

-Los recipientes más frecuentes donde se ponen son tubos de ensayo, placas de Petri o si se utilizan en medio líquido en matraces, pero pueden ser todos los que quieras. TIPOS DE MEDIO DE CULTIVO PARA EL CRECIMIENTO BACTERIANO Y SUS USOS -En función de su naturaleza física: .. Líquido (caldo o broth): para incrementarla cantidad del microorganismo. .. Semi-sólido: agar. .. Sólido: caldo solidificado como agar (es un polvo y su ventaja es que con el calor no se funde, nosotros hacemos una suspensión en agua, para fundirlo lo tenemos que llevar por encima de 100 grados y entonces es cuando se funde. Pero cuando nosotros lo dejamos solidificar no lo hace hasta por debajo de los 45 grados. Los polisacáridos son difíciles de degradar, hay muy pocas bacterias que se coman el agar), la gelatina (fue el primer agente solidificante que se utilizó, pero la gelatina no aguantaba a altas temperaturas, muchos microbios se lo comían…), silicagel (se utiliza fundamental para la microbiología de suelo) o cualquier otro agente solidificante. Al principio es líquido y después se solidifican. Otros polímeros como el curdlano, que también se puede utilizar para solidificar medios de cultivo, pero es muchísimo más caro que el agar. Placas de Petri: para aislamiento de colonias puras. Se llena con agar fundido y después se solidifica. Tubos de agar inclinados: para almacenamiento en períodos de tiempos cortos o medios y transporte, pero para periodos cortos. Se tiene que solidificar el agar con el tubo inclinado. El tubo se tiene que poner en un plano inclinado. Se suelen sembrar con el asa de Kolle. También existen los de agar rectos. También hay un tercer tipo que es una inclinación menor que es el que sería en pico de flauta, que sería un tubo donde la inclinación es muy poca de tal manera que hay una parte recta que se siembra por picadura y una inclinada que se siembra por estría. -En función de su origen. Naturales, se utilizan muy poco. Sintéticos, hay dos tipos. ..Definidos: se conoce cualitativamente y cuantitativamente su composición. ..Complejos: no se conoce su composición exacta, ni cualitativamente ni cuantitativamente sus componentes o alguno de ellos. Y podemos poner una sustancia, como la peptona, que sabemos que ponemos 15 gramos, pero no sabemos bien de qué está formado. También con extractos de levadura o de carne. No necesariamente tiene porque ser un medio rico un medio complejo, pero normalmente sí. --Aquí tenemos unos ejemplos de medios definidos. ..Medio para las cianobacterias (nitrato sódico, fosfato, una serie de sales, todos son perfectamente definidos) ..Medio para Escherichia coli sales minerales, glucosas, todas perfectamente definidas. --Ejemplos de medios complejos. El Nutrient Broth lleva peptona y extracto de carne que no se sabe la composición. Otro por ejemplo lleva triptona, peptona, glucosa, cloruro de sodio, fosfato de dipotasio (es el Tryptic Soy Broth). I el MacConkey Agar también es complejo, tiene peptonas, sales biliares que tampoco se sabe la composición. El agar de MacConkey también es uno que se utiliza mucho. -Si nos interesa separar las distinguir poblaciones que hay en un medio vamos a recurrir a medios sólidos. Si nos interesa tener muchos individuos de una población que ya la hemos separado utilizaremos un medio líquido.

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-Hay algunos medios como el TSA (sólido) o el TSB (líquido) pero no son exactamente iguales. TSA sólo la triptona de soja i el TSB también tiene 0,2% de glucosa. El TSA no es el TSB solidificado pero es una excepción. -En función de su aplicación -Medios no selectivos u ordinarios: TSA, TSB… pueden crecer un montón de micros en ellas. -Medios mínimos: hay los nutrientes mínimos para que crezcan los micros mínimamente. Y así los nutrientes se consumen rápidamente y se emplean para algunos estudios especiales para estudiar relación nutriente-Medio rico: le sobran los nutrientes a la bacteria. -Medio de enriquecimiento: nosotros vamos a favorecer una población sobre el resto de las poblaciones que lo acompañan. Lo hacemos por ejemplo poniendo los nutrientes que más favorecen a una determinada población (tipos efectivos) o poniendo compuestos que maten a las demás poblaciones (tipos selectivos). Se suelen utilizar los selectivos porque es más cómodo y se acaba más rápido. ..Por ejemplo el cristal violeta inhibe los gram positivo, y lo ponemos cuando queremos enriquecer el gram negativo. ..Y el telurito potásico, acetato de talio y el ázida sódica mata a los gram negativo. Pero el medio selectivo nunca es tan selectivo para que permita el crecimiento de una sola población. Siempre habrá pequeñas cantidades de las demás poblaciones. -Medios diferenciales: son aquellos que permiten expresar una característica de una población que nos va a servir para diferenciarla de otra población. Por ejemplo un medio diferencial ería el agar sangre, en el cual se le pone sangre en una proporción de 5%. Este agar es diferencial porque hay unas bacterias que producirán las hemólisis de los hematíes. Dentro de los que rompen los eritrocíticos habrá unos que rompen de una manera (alfa-hemólisis, hemolisis incompleta o de otra (beta-hemólisis, hemólisis completa). Así veremos un halo transparente o un halo verdoso, y así podremos diferenciar las bacterias. Si no hace hemólisis se llama gamma-hemólisis. -Hay medios selectivos que a su vez son diferencial como el agar MacConkey, que lleva colorantes, sales biliares… que seleccionará bacterias gram negativas (selectivos). Pero a este agar se le adiciona lactosa que hay unos bacterias que utilizan la lactosa y acidifican el medio y otros no utilizan la lactosa y no acidifican el medio por tanto. Y así comprobando el pH sabremos qué tipos de bacteria es. Otro ejemplo de medio selectivo-diferencial es el agar manitol hipersalino lleva altas concentraciones de sal. En ese medio, las bacterias que nos sean capaces de toleras esas concentraciones de sales no crecerán (selectivo): Es diferencial porque llevan manitol y hay pocas bacterias que sean capaces de utilizarlas. ..Estos medios son los que se usan más. -Medios de base: es una especie de medio donde se han puesto nutrientes generales pero para que esté el medio completo le falta un ingrediente. Por ejemplo, tenemos el agar Hugh-Leiffson, que así vemos si los micros son capaces de utilizar un nutriente o no. Este agar tiene un colorante que le da un color al medio, peptona (para que crezcan las bacterias). A este medio base le añadimos por ejemplo glucosa, sembramos las bacterias por picadura, y si utilizan la glucosa (el nutriente que queramos ver) el tubo pasará de verde a amarillo y si no la utilizan se quedará verde, como mucho se pondrá azul se utiliza la peptona. -Medios deshidratados: son medios que se venden deshidratados. -Medios de transporte: de hecho no son medios de cultivo. Es sencillamente un medio que lo que permite es mantener el micro durante unas horas sin que se muera. Le ponemos humedad, presión osmótica adecuada para que no se muera pero no para que crezca. Se utiliza una clínica cuando se toma una muestra para analizarla. 10

-VRBG Agar: tiene cristal violeta y no sé qué más. -Medio EMB (Eosin-Methylen-blue): fermentadores de lactosa-colonias oscuras que tienen un brillo metálico. TIPOS DE SIEMBRA -Cuando queremos sembrar en medio sólido. - Normalmente se utiliza el asa de Cole. Primero se flamea el asa, se toma la muestra y se deposita haciendo estrías inicialmente. Nosotros tocamos con el asa la muestra y descargamos en una zona, una vez que hemos descargado, volvemos a la flama y a continuación desde nos habíamos quedado antes seguimos, para arrastrar bichos de las rayas iniciales, volvemos a flamear… como nos quedan rallas se llama método por estrías. Realmente nosotros estamos haciendo una dilución. Este sistema se utiliza por eso para hacer aislamientos en medios sólidos. En el método por estrías, se inocula la mezcla microbiana sobre un extremo de la placa de agar con un asa de siembra o un hisopo, y se extiende formando estrías sobre las superficie en uno o varios sentidos. Las células individuales se irán desprendiendo del asa al frotarla sobre la superficie y desarrollarán colonias aisladas. -Otro sistema de siembra, el de picadura, ya hemos hablado. -Siembra en agar en tubo inclinado o bisel: en este caso se colocan 5 ml de medio de cultivo fundido y estéril, se inclina el tubo y se deja enfriar. El inóculo se siembra, con ayuda de asa, de la siguiente manera: • En profundidad con ansa de punta: se pica con el asa el cultivo a sembrar y se introduce mediante punsión en el medio contenido en la parte inferior del tubo. • En superficie con ansa de aro: se pica con el ansa el cultivo a sembrar y se esparce el mismo sobre la superficie en bisel en forma de zigzag. -El inóculo es introducido con el asa recta o pipeta pasteur hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado en hacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Debe flamearse la boca del tubo antes y después de la siembra. Antes de introducir el tubo a la estufa de cultivo debe soltarse el tapón de goma para evitar que los gases expulsen el tapón. -Siembra por inclusión o por inmersión: nosotros preparamos y tenemos un cultivo líquido o sólido y preparamos una suspensión de distintas diluciones y en el agar cuando está fundido, cuando está entre 45-50ºC a más no, ponemos la suspensión del micro y homogeneizamos y después vertemos el tubo sobre la placa. Cuando nosotros siembra por estría sólo utilizamos la superficie y aquí utilizamos todo el volumen de la placa. La ventaja de éste es que aprovechamos más el volumen y podemos utilizar más cantidad de medio para sembrar. Siembra por inmersión: se coloca el inóculo en una placa o caja de Petri y sobre el mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido. Este método se utiliza para microorganismos aerobios. -Siembra por inundación: no nos interesa separar, queremos un crecimiento en sábana, que crezca de manera uniforma por toda la superficie del agar. Sembramos mucha cantidad en medio líquido se distribuye y después se saca. Se emplea poco. MÉTODOS DE OBSERVACIÓN Y TAMAÑO -Lo primero y más inmediato para describir un microorganismo es el observar el aspecto de las COLONIAS que forman las poblaciones microbianas. -La observación se pude hacer a simple vista o con ayuda de una lupa. -Una especie microbiana cultivada en las mismas condiciones de medio de cultivo y ambientales, la morfología colonial es una característica conservada. En la morfología colonial vemos: ..La forma: circular (más que punctiforme), filamentosa, punctiforme (muy pocas), irregular, rizoide y spindle. 11

..Elevación: si es plana o elevada, si es umbonada (como un sombrero mejicano el centro más elevado que laterales) si es convexa y pulvinada. ..Margen: si es liso, entero, ondulado, lobulado, erosionada, filamentoso, curied. ..Superficie: lisa, rugosa, mucosa, cremosa… La superficie lisa se ve brillante. ..Opacidad: si es opaca o no. ..Cromogénesis: el color.

MICROSCOPÍA Y MORFOLOGÍA CELULAR -Microscopía fotónica (el microscopio compuesto, por tinciones simples, y por tinción diferencial, el microscopio de contraste de fases, el microscopio del campo oscuro y el de fluorescencia. La fuente de iluminación es la luz normal. -Los microscopios de imagen tridimensional (el confocal, el de contraste diferencial, de interferencia el de fuerza atómica). - La microscopía electrónica (el de transmisión y el de barrido). Cuando queremos hacer una observación de una colonia tomamos el asa de cole, y se deposita sobre un portaobjetos. Lo primero que necesitamos es hacer una fijación. Se extiende y después hacemos la fijación en el portaobjetos. Lo normal es la fijación por calor, al lado de la llamo del mechero, muy brevemente, y con eso es suficiente para fijar. A partir de esta fijación vendría ya la tinción propiamente dicha. ..Tinción en fresco (en invierno sin calefacción XD): Se hace la suspensión igual pero no fijamos, sino que se observa tal cual. Y encima se pone el cubreobjetos. Esto en un microscopio de campo claro no veríamos casi nada. Cuando queremos hacer una preparación de estos en fresco normalmente se utiliza para hacer movilidad y se emplea un portaobjeto especial que se llama portaobjetos excavado. Se utilizan portaobjetos especiales con una o varias excavaciones, se coloca una gota de la suspensión en el centro de un cubreobjetos (limpio y seco) con un asa previamente estéril. A continuación, recoloca el porta sobre el cubreobjetos, de forma que la gota queda suspendida con el centro de la excavación. Después se le da la vuelta rápidamente al portaobjetos manteniendo el cubre en su posición. Y esto es el método de la gota pendiente. Como mucho ponemos en el objetivo el 40X. Cuando queremos ver más detalle utilizamos el campo oscuro (tiene un condensador especial que sólo ilumina el objeto y lo otro no) y el de contraste de fases (maximizamos la pequeña diferencia de contraste y así se puede ver con más detalle). -Observaciones con tinción. Hay los colorantes de tipo básico (tienen una carga positiva, y son los más utilizados, como la safralina, el cristal violeta, el azul de metileno) y los colorantes ácidos (eosina, rojo congo…). ..Tinción simple: se hace la extensión y se ponen los colorantes, como azul de metileno, rosa bengala, safralina…). Y después ya se hace la observación. Si queremos ver un microhongo no se hace fijación sino que muchas veces se hace directamente la tinción. ..Tinción diferencial: emplean dos colorantes, que nos permitirán diferenciar respuestas diferentes según los grupos de los microorganismos. Dentro de aquí hay la tinción de gram (nos separa los gram positivos de los gram negativos), Vamos a fijar un colorante, el primero lo tiñe todo, el segundo colorante solo teñirá aquellas estructuras que han quedado liberadas del primer colorante. ..Cuando se pone un poco del primer colorante, se pone una solución de iodo durante 3 minutos, y después ya acabamos de poner el primer colorante.

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