TEMA 07: BIBLIOTECAS Y BANCOS DE GENES PDF

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TEMA 7: BIBLIOTECAS Y BANCOS DE GENES BIBLIOTECAS Tipos: Una biblioteca, minibiblioteca, genoteca, banco génico, etc. Se trata de una mezcla de fragmentos de DNA clonados en el mismo vector.  Biblioteca genómica o genoteca: por ejemplo a partir de tDNA de un tejido eucariota, incluye todo el contenido genético de la especie y puede llegar a ser muy grande.  Minigenoteca: por ejemplo a partir del DNA de un megaplásmido bacteriano.  Biblioteca de cDNA: por ejemplo a partir del mRNA de un tejido, y que representa a los genes expresados en ese tejido concreto. Es mucho menor y más fácil de preparar y manejar, y no incluye intrones. Es expresable en bacterias (biblioteca de expresión). Objetivos:  Conservación del contenido genético de una estirpe, órgano, organismo.  Aislamiento de secuencias o de genes (screening).  Estudio de grandes regiones genómicas o genomas enteros: genómica. Screening de bibliotecas: aislamiento de genes  Siembra en placa(s), toma de filtros e hibridación con sonda marcada. Puede ser una sonda homóloga o un oligonucleótido sintético hecho a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína (ojo al uso de codones). El gen no tiene por qué expresarse, la sonda lo localizará aunque esté fragmentado.  Siembra o cultivo y detección de actividad codificada en pasajero. Por ejemplo: aislamiento de un gen que codifica una actividad enzimática detectable (producto coloreado como β-galactosidasa sobre un medio con X-gal). Otro ejemplo: aislamiento de un gen que codifica la resistencia a un metal (merR): hacemos crecimiento de la biblioteca en concentraciones del metal no toleradas por el hospedador (screening y selección). (*)  Siembra o cultivo y complementación de mutación en hospedador. Por ejemplo: aislamiento de un enzima anabólico de Pro en un mutante Pro: crecimiento de la biblioteca en ausencia de Pro (screening y selección). (*)  Siembra, toma de filtros y detección con anticuerpo (inmunoscreening). (*) (*) Se requiere la expresión del inserto.

Características:  Representatividad: una biblioteca es representativa cuando tenemos una garantía de que vamos a tener todo el genoma.  Complejidad o tamaño de la genoteca (N): número mínimo de clones independientes para que el 100% del material de partida esté representado; en parte depende del tamaño del material inicial (T) [genoma de E. coli (4.10^6), genoma humano (3.10^9], y por otro del tamaño medio de fragmentos.  Tamaño medio de inserto (t): importante para genes eucariotas. También influye en la complejidad. En realidad: N depende de T/t. T = 3 x 10^6 kb; t = 4 kb; mínimo de 7’5 x 10^5 clones independientes. T = 3 x 10^6 kb; t = 20 kb; mínimo de 1’5 x 10^5 clones independientes.  En la práctica N debe ser mayor que T/t. La probabilidad de que el número de colonias o fagos aislados (N) que se necesitan obtener para alcanzar una probabilidad, P, de que entre ellos se encuentre presente una determinada secuencia n veces más pequeña que el genoma de donde procede (n=T/t) es: N = ln (1-P) / ln (1-1/n).

CONSTRUCCIÓN DE BIBLIOTECAS Digestión total con enzima de diana media (6 pb): La biblioteca es de un tamaño promedio de 4 kb, que podemos insertar en un vector normal. Rotura no estadística, puede haber fragmentos muy alejados del tamaño promedio. Así la reprentatividad de grandes fragmentos puede ser baja, y de los pequeños, alta, y nos entra el problema de dónde insertarlos (vector). De alta complejidad y de dificultad en el mapeo posterior. Ejemplo con EcoRI. Digestión total con enzima de diana larga (8 pb o más): De tamaño promedio muy grande (65 kb), requiriendo un vector de gran capacidad. De rotura no estadística. La complejidad es menor y el mapeo más sencillo. Rotura por métodos físicos (inespecífica) y tailing: De tamaño medio en función de las condiciones. De rotura estadística, genera tamaño piezas más homogéneas y tiene mayor representatividad por tanto. La complejidad es controlable y los fragmentos solapantes. El problema es que la ligasa no puede unir extremos compatibles, por eso requerimos el tailing.

Digestión parcial con enzima de diana corta (4 pb): Se usan por ejemplo:  MboI ó Sau3A [‘GATC], compatible con BamHI [G’GATCC].  TaqI [T’CGA] ó HpaII [C’CGG] De tamaño medio en función de las condiciones. De rotura aproximada a la estadística, de fragmentos más homogéneos y representativa. De complejidad controlable, con fragmentos solapantes y con la posibilidad de aislar genes enteros. Vectores para la construcción de bibliotecas:  Capacidad de clonaje: plásmidos, fagos, cósmidos, YACs, BACs.  Amplificación y mantenimiento: distorsión.  Expresión del pasajero. Estudio de grandes regiones:  Paseo cromosómico (walking).  Saltos cromosómicos (jumping)....