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Microbiología general Tema 11

Tema 11 Pruebas bioquímicas de identificación bacteriana. 11.1 Criterios para la clasificación e identificación de las bacterias. Caracteres morfológicos:  Macroscópicos: Crecimiento en medios líquidos y sólidos, en medios selectivos y diferenciales, colonias y pigmentos.  Microscópicos: Tinciones (Gram), tamaño, morfología, agrupamientos, estructuras (esporos).  Caracteres fisiológicos: Como la movilidad, hemólisis, requerimiento de O2 o Tª Caracteres bioquímicos (Biotipado).

11.2 Características morfológicas Características macroscópicas: Forma, tamaño, borde, elevación, coloración, pigmento, hemolisis, otros. Agar sangre: Medio de cultivo enriquecido con la adicción de sangre. Las hemolisinas son enzimas que lisan los hematíes. Las bacterias que producen estas enzimas presentan un halo transparente alrededor de las colonias a consecuencia de la lisis de los hematíes. Hemolisis alfa (α): hemólisis verde, incompleta o parcial (Figura 11.1).  Produce H2O2: oxidación de hemoglobina a metahemoglobina (verde).  Ejemplos: Str. pneumoniae, Str. suis (a veces beta) Clostridium perfringens (doble hemólisis al provocar también beta). Hemolisis beta (β): hemólisis completa. (Figura 11.2).  Produce una hemolisis completa de los hematíes.  Ejemplos: Clostridium perfringens produce doble hemolisis al provocar también alfa. Hemolisis gamma (γ): (Figura 11.3).  No se produce hemolisis.  Ejemplos Enterococcus faecalis (a veces alfa y beta). E.coli (alguna cepa hemolisis beta).

Figura 11.1

Figura 11.2

Figura 11.3

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11.3 Pruebas bioquímicas de identificación bacteriana. Estudios de las modificaciones producidas por la actividad metabólica de las bacterias, sobre los medios de cultivo o sustratos metabólicos, con fines de identificación (técnicas cualitativas). Clasificación:  De lectura directa: Los productos de la reacción se ven a simple vista.  De lectura indirecta: Mediante un indicador añadido al medio. Mediante un reactivo añadiendo un reactivo. Actividad glucidolítica: Acidificación de azucares, investigación de la beta-galactosidasa (ONPG), pruebas de Voges-Proskauer/Rojo Metilo.  

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Principio: La utilización que una bacteria hace los hidratos de carbono tiene lugar por alguno de estos procesos: fermentación u oxidación. Algunas bacterias son capaces de metabólicas un carbohidrato solo en condiciones aeróbicas (aerobias estrictas), mientas que otras producen acido tanto aeróbica como anaeróbicamente (anaerobias facultativas). La diferencia principal entre el metabolismo fermentativo y oxidativo depende de los requerimientos de O2 atmosférico y de la fosforilación inicial de la glucosa.  Fermentación: No oxígeno (anaeróbico), si se da la fosforilación inicial de la glucosa.  Oxidación: Si oxígeno (aerobio), no hay fosforilación inicial de la glucosa. Produce: Ácidos orgánicos y gas (H2 o CO2). Detección: Incluyendo en el medio un indicador de pH y una campana de Durham. Utilidad: Para diferenciar especies, sobre todo de bacterias entéricas. Técnica: Se inocula la bacteria en un medio conteniendo una pequeña cantidad de peptona (fuente de nitrógeno) y una fuente de carbono fermentable al 1% - 2%, un indicador de pH y una campana de Durham.

 Actividad glucidolítica: Oxidación-Fermentación  Medio OF: Contiene una elevada concentración de carbohidratos (10%) con una baja concentración de peptona (1%).  Evalúa: la capacidad de las bacterias para oxidar y/o fermentar produciendo acido.  Utilidad: Distinción de Pseudomonas y enterobacterias.  Técnica: Se inoculan tubos de medio con asas de punta recta. Uno de los tubos se recubre con aceite de parafina para aislarlo del oxígeno (tubo de fermentación) y otro no (tubo de oxidación). Actividad glucidolítica: investigación de la beta-galactosidasa.  Beta-galactosidasa: Hidroliza la lactosa originando glucosa y galactosa.  Técnica: se añade un sustrato artificial orto-nitrofenil galactopiranósido (ONGP).  Ejemplos: Ciertas especies de Salmonella (S.choleraesuis). Corunebacterium bovis.

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Actividad glucidolítica: Pruebas de Voges-Proskauer/Rojo Metilo Utilidad: Diferenciación de enterobacterias del grupo E.coli y Klebsiella-Eneterobacter. Las enterobacterias son anaerobias facultativas que utilizarán la glucosa en dos fases: primero la metabolizarán aerobiamente consumiendo rápidamente el oxígeno del medio, para en segundo lugar continuar metabolizándola por vía anaerobia (fermentación)  Esta prueba puede ser de dos tipos:  Fermentación acido mixto: La realizan las bacterias del grupo E.coli y los productos finales son ácidos orgánicos (ácido fórmico, acético, láctico y succínico)  Fermentación butilén glicólica: La realizan las bacterias del grupo KlebsiellaEnterobacter. Los productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína.  Para la realización de estas dos pruebas se cultiva el microorganismos en el caldo MRVP (medio de Clark y Lubs; peptonas, glucosa y buffer) se incuba a 30ºC durante 3 días como mínimo y 5 días como máximo. Al revelar las pruebas, se separa el cultivo en dos porciones de unos 2,5ml que servirán para cada uno de los ensayos.  Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le añaden unas gotas (4-5) de la solución indicadora de Rojo de Metilo, agitando para homogeneizar y se observa la coloración.  Se considera positiva (presencia de ácidos) si vira al rojo y negativa si permanece amarilla.  Voges-Proskauer: A la otra porción del cultivo se le añaden 0,6ml de Reactivo A (alfa-naftol 5% etílico absoluto), el medio adquiere un aspecto lechoso. Y 0,2ml del reactivo B (KOH 40%). Desaparece el aspecto lechoso y se agita fuertemente  Se considera positivo si antes de 5 minutos aparece un color rosáceo-violáceo, más o menos intenso, que se inicia en la pared superior del tubo. Por otro lado será negativo si no aparece coloración.  Actividad proteolítica: Hidrólisis de la gelatina, hidrólisis de la caseína.  

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Principio: Las proteínas naturales son demasiado grandes para ser transportadas dentro de las células por lo que las bacterias secretan enzimas extracelulares que hidrolizan los polímeros para ser transportados al interior de la célula en monómeros que le sirven para crecer. Técnica: La producción de proteasas es evaluada por incorporación de una proteína (gelatina o caseína) en un medio solido en placa. Ejemplo: Caseína (Gº Bacillus, Serratia). Gelatina (Proteus spp. St aureus, T. pyogenes). (Figura 11.4/11.5)

Figura 11.4

Figura 11.5

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Actividad amilolítica: Hidrólisis del almidón. Actividad lipolítica: Hidrólisis del Tween, hidrolisis de la yema de huevo, presencia de lipasas, presencia de esterasas. 

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Principio: Algunas bacterias excretan lipasas extracelulares que pueden hidrolizar lípidos grandes en sustratos de bajo peso molecular que son trasportados al interior de la célula para ser utilizados en el crecimiento. Técnica: Una emulsión de lípidos y un indicador llamado Spirit Blue se incorporan en un medio sólido complejo Ejemplos: Clostridium botulinum (otras especies variables). Proteus spp. (variable). St. aureus, Ps. aureusginosa (variable otras especies). (Figura 11.6/7)

Figura 11.6

Figura 11.7

Actividad descarboxilasa o desaminasa. 

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Principio: Los aminoácidos al perder el grupo carboxilo convierten en aminas que incrementan el pH del medio y el indicador (púrpura del bromocresol) vira a violeta. Las descarboxilasas son útiles en la diferenciación de enterobacterias. Condiciones: Anaeronbiosis. Técnica: Las bacterias se inoculan en medios complejos que contienen lisina, ornitina o arginina al 1% y un indicador de pH (púrpura de bromocresol). Ejemplos: Útil en enterobacterias. E.coli y Salmonella spp. (la mayoría) +; Citrobacter y Shigerlla -. (Figura 11.8/9)

Figura 11.8

Figura 11.9

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Reducción del nitrato: 

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Principio: Algunas bacterias pueden usar nitratos como aceptor final de e- en la respiración. el nitrato puede ser reducido a nitrito o en un paso más a gases (óxidos de nitrógeno). Técnica: Las bacterias se inoculan en medios conteniendo nitrato potásico. El nitrito procedente de la reducción de células puede detectarse añadiendo alfanalfilamina y ácido sulfanílico produciéndose un color rojo. Se puede saber si el nitrato puede haberse reducido a más que a nitritos produciéndose gas. Si al añadir zinc en polvo no hay color rojo es que no hay nitrato porque se ha reducido a gas (desnitrificación). Ejemplos: Las Enterobacterias (ciertas especies de Yersinia y Serratia son negativas) y Pseudomonas son usualmente positivos. Otras: Bordetella sp, Moraxella sp, Neiseria sp. (Figura 11.10/11)

Figura 11.10

Figura 11.11

Prueba del indol:     

Principio: Producción de indol a partir del triptófano Técnica: Añadimos reactivo Para-dimetilaminobenzaldehido (reactivo de Kovacs) Resultados: Positivo si hay cambio de color en la superficie.(Rosáceo) Ejemplos: E.coli (+); Salmonella spp. Yersinia spp. Enterobacter spp. (-). (Figura 11.12) Positivo

Negativo

Figura 11.12

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Prueba del citrato: 

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Principio: Determina si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono para el metabolismo y crecimiento, provocando alcalinidad. El desdoblamiento del citrato comprende un sistema enzimático sin la intervención de la coenzima A. Esta enzima se denomina citrata sa. Medio: Incluye citrato de sodio, un anión como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Técnica: Inocular en el medio. El inoculo debe ser pequeño, si es demasiado grande, compuestos orgánicas preformados dentro de la pared celular de las bacterias que están muriendo pueden liberar suficiente carbono y nitrógeno y dan lugar a un falso positivo. Ejemplos: Positivo, da un color azul (Salmonella spp. Klebsiella spp. Enterobacter, Proteus spp. variable). Negativo, da un color verde (E.coli, Yersinia spp.). (Figura 11.13)

Prueba del agar hierro de Kligler: 

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Principio: Determina la capacidad de un organismo de utilizar un hidrato de carbono específico en un medio de crecimiento básico, con producción o no de gases, junto con la determinación de la posible producción de ácido sulfhídrico. Medio TSI (equivalente pero con 3 azúcares) Valoración:  Metabolismo oxidativo y fermentativo de la glucosa. (2)  Metabolismo oxidativo y fermentativo de la lactosa. (4)  Producción de gas a partir de la glucosa. (1)  Producción de ácido sulfhídrico. (3) (Figura 11.14)

N

P

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3

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Figura 11.14 Figura 11.13

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Resultados:  Pico acido/fondo acido (pico/fondo amarillo): El microorganismo fermenta glucosa y lactosa. E.coli, Klebsiella, Yersinia enterocolitica, Citrobacter.  Pico alcalino/fondo acido (pico rojo/fondo amarillo): El microorganismo solo fermenta la glucosa. Salmonella, Yersinia pstbc y pestis, Eneterobacter, Proteus.  Pico alcalino/fondo alcalino (Pico/fondo rojo): El microorganismo es no fermentador de azucares. Pseudomona aeruginosa.  Producción de gas: Presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo. E.coli, S.enteritidis, P.mirabilis, Klebsiella.  Producción de ácido sulfhídrico: ennegrecimiento del medio. Salmonella (NO S.choleraesuis), Proteus spp.

11.4 Otras pruebas. Movilidad: La movilidad de las bacterias es consecuencia de la presencia de flagelos. El movimiento puede observarse en preparación en fresco con microscopio de contraste de fase o en medio semisólidos. En fresco: es importante diferenciar del movimiento Browniano debido a las corrientes en la preparación. Medios de cultivo: SIM Ejemplos: Enterobacterias, muchos géneros menos Klebsiella. (Figura 11.15)1

CN

N

P

Figura 11.15

Figura 11.16

Prueba de SIM (SULFUR INDOL MOTILITY):  Componentes:  Tripteína (fuente de triptófano): se oxida a indol + reactivo de Kovacs: color rojo.  Peptona.  Sulfato de hierro y amonio.  Tiosulfato de sodio.  Agar.

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Medio en el que solo visualizamos movilidad no es un medio SIM.

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Valoramos:  1 Producción de H2S: Color negro (+).  2 Producción de Indol: Con reactivo de Kovacs depositado en la superficie color rojo (+).  3 Movilidad: Turbidez a partir de la inoculación. Ejemplos: 1+ 2- 3+ (Salmonella, Proteus). 1- 2+ 3? (E.coli). 1- 2- 3- (Klebsiella). (Figura 11.16).

Prueba de la catalasa.   

Principio: La catalasa es una enzima que protege a las células frente al H2O2 producido en el metabolismo del O2. Cataliza la formación de H2O y O2 a partir del H2O2. Utilidad: Distinguir Streptococcus (negativa) de Staphylococcus (positiva) y Clostridium (negativa) de Bacillus (positiva). Técnica: Se añade unas gotas de H2O2 sobre las colonias en placa que no sea de agar sangre (daría un falso positivo). La producción de burbujas indica la presencia del enzima. (Figura 11.17)

Figura 11.17

Figura 11.18

 Prueba de la oxidasa:  

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Principio: Organismos que viven en medios con oxígeno (aerobios), producen enzimas como la citocromo oxidasa. Utilidad:  Negativos: Enterobacter.  Positivos: Pseudomonas; otras (Campylobacter, Moraxella, Helicobacter, Neisseria, Vibrio, Legionella). Técnica: Añadir reactivo de oxidasa (tetrametil-para-fenilendiamina) en papel de filtro, es positivo si se vuelve azul. (Figura 11.18)

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Galerías API. Son una serie de pruebas comercias en una tira para diferentes aplicaciones y determinaciones seriadas de una cepa. En estas pruebas comerciales se realizan múltiples pruebas bioquímicas de forma más rápida, además los resultados se llevan a una base de datos en la cual nos dirá que especie estamos determinando. (Figura 11.19)

Figura 11.19

11.5 Conservación de cepas. Objetivos: Mantener intactas todas las características biológicas, bioquímicas, fisiológicas, morfológicas y antigénicas de las cepas aisladas. Establecer el mantenimiento de las cepas microbianas de referencia. Almacenamiento de antígenos vacunales y diagnósticos. Almacenamiento de cepas que se han erradicado con el fin de poseer referencias ante posibles brotes. Procedimientos: Conservación a largo plazo:  Congelación con medios de cultivo que contienen glicerol (desde -30ºC a -80ºC) meses a años.  Liofilización (congelación y posterior sublimación) Conservación a corto plazo:  Por trasferencia periódica: medios de cultivo + refrigeración preservados de la luz, normalmente en agar inclinado. Poco tiempo.  Por suspensión en agua destilada o agua de mar estéril.

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11.6 Banco de cepas. Colecciones de cultivos tipo: Son colecciones de microorganismo con determinadas características que conservan distintos países. Sin ánimo de lucro. Se ceden para experimentos y contrastaciones a laboratorios reconocidos. Las cepas que poseen están perfectamente estandarizadas con su nomenclatura y referencias. Cuando se encuentra una cepa nueva, ya contrastada, se recomienda que se deposite en esas asociaciones a fin de que toda la comunidad interesada en ella tenga posibilidades de conseguirla. 

Ejemplos:  American Type Culture Colección (ATCC).  European Culture Collection Organization (ECCO).  Colección Española de Cultivos Tipo (CECT).

11.7 Envío de muestras. El envío de muestras se puede realizar con dos enfoques diferentes  Prospectivo: Se envía solamente un ejemplar por muestra. Sirve para conocer las características microbiológicas de la muestra.  Oficial o reglamentario: Por triplicado, se toman 3 ejemplares homogéneos por muestra:  Análisis inicial  Análisis contradictorio  Análisis dirimente

11.8 Toma de muestras (Formulario o impreso del análisis). Con utensilios y recipientes adecuados, de uso alimentario, estériles. Se permitirá que el propietario del alimento este presente. Se colocaran en bolsas cerradas herméticamente, precintadas e identificadas si son oficiales. Deben ir perfectamente identificadas todas con el nombre del que la toma, en presencia de quien, lugar, fecha, hora, para que se toma, investigaciones solicitadas, naturaleza, origen de la muestra y registros que le acompañen. La muestra ira siempre acompañada de un ejemplar del Acta de Toma de Muestras.

11.9 Transporte de muestras. Las muestras se transportarán y almacenarán bajo condiciones que impidan cambios en los recuentos microbianos.  Los alimentos congelados deben mantenerse en tal estado  Los enfriados/refrigerados se conservaran entre 0ºC-5ºC y no se congelaran.  Los alimentos en caliente se mantendrán refrigerados.  Los alimentos deshidratados y los botes sin abombar no necesitan refrigerarse. El envío se debe realizar lo más rápido posible.

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