TEMA 28. BÚSQUEDA, AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS Y NUEVOS METABOLITOS DE INTERÉS INDUSTRIAL PDF

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Apuntes completos de Microbiología. Profesores: V. Jiménez Cid, M. Molina Martín y C. Gil García....

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TE TEMA MA 228. 8. B BÚS ÚS ÚSQU QU QUE EDA DA,, A AISLA ISLA ISLAM MIE IENTO NTO E ID IDENT ENT ENTIIFICA FICACIÓ CIÓ CIÓN N DE MIC MICRO RO ROO ORG RGAN AN ANISM ISM ISMO OS Y NU NUEV EV EVOS OS MET ETAB AB ABOLI OLI OLITO TO TOSS DE IINT NT NTER ER ERÉS ÉS IN INDU DU DUST ST STRI RI RIAL AL REQ REQUIS UIS UISITO ITO ITOSS DE U UN NM MICRO ICRO ICROOR OR ORGAN GAN GANISM ISM ISMO O INDU INDUSTR STR STRIAL IAL 1. Producción de una sustancia de interés industrial. 2. Aislar de cultivo axénico. 3. Rápido crecimiento. - Se evita usar largo tiempo un equipo costoso. - El control de factores ambientales es más fácil. - Se evitan contaminaciones. 4. Protección frente a la contaminación (pH, Tª, bacteriocinas...). 5. Crecimiento en medios líquidos, baratos, a gran escala. 6. Requerimientos nutricionales no exigentes. 7. Seguridad sanitaria. 8. Fácil separado y procesado. 9. Susceptible de manipulación genética y estable. 10. Conservación.

BÚS BÚSQU QU QUEDA EDA EDA,, AIS AISLA LA LAMIE MIE MIENTO NTO E IDEN IDENTIF TIF TIFICAC ICAC ICACIÓ IÓ IÓN N - Búsqueda (Bioprospección): Elección del hábitat. - Aislamiento: Medios y condiciones selectivas. - Identificación.

ME MEJOR JOR JORA A DE LA LASS C CEPA EPA EPASS IN INDU DU DUSTR STR STRIALES IALES Estas mejoras suelen ser mejoras genéticas a través de mutaciones. El microorganismo se mutageniza y se siembra separando cada cepa. El analizador detecta de todos los mutantes, cuál es el que produce un mayor halo en el medio y esta es la cepa que seleccionaremos. Cogemos la cepa, la trasladamos a un tubo y sembramos en otro medio, separado de las demás cepas. Normalmente se seleccionan mutantes naturales o se fuerzan.

Op Optimiz timiz timización ación d de e cep cepas as - Selección natural de variantes (mutación espontánea). - Selección de mutantes inducidos: incremento del rendimiento. Ej: selección de mutantes hiperproductores de lisina, resistentes a componentes del medio (aislamiento de mutantes de P. chrysogenum resistentes a fenilacético, precursor de la penicilina y tóxico a elevadas concentraciones). - Obtención de recombinantes genéticos: • Transferencia de información genética entre organismos diferentes. • Fusión de protoplastos. - Utilización de la ingeniería genética: ingeniería metabólica. Dirigimos el metabolismo hacia el metabolito que más nos interese.

Utili Utilizac zac zación ión de la in inge ge genie nie niería ría gen genétic étic éticaa en la mejor ejoraa d de e ce cepas pas ind indus us ustriales triales (ing (ingen en enierí ierí ieríaa m metab etab etabólica ólica ólica)) - Modificación de la cantidad o calidad de enzimas que intervienen en una ruta metabólica: • Modificación de la dosis génica. o Vectores de alto número de copias. o Integraciones múltiples. • Modificación de la expresión génica. o Promotor fuerte (regulable o constitutivo). Un promotor constitutivo es el que se expresa desde el primer momento. • Modificación de las características de la enzima (ingeniería bioquímica). o Estabilidad (T, proteolisis, etc). o Actividad, especificidad. o Desregulación. • Combinación de rutas de diferentes orígenes.

Cons Conservaci ervaci ervación ón d de e micr microorgan oorgan oorganis is ismos mos Objetivos: - Que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de conservación. - Que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos el 70-80% de las células. - Que estas células permanezcan genéticamente estables. Métodos: - Congelación (factores: edad, velocidad de congelación, temperatura, crioreceptores). Por debajo de -132ºC en la congelación del agua no se forman cristales que puedan dañar las membranas celulares, por lo que las bacterias que congelemos durarán mucho tiempo. También se puede utilizar nitrógeno líquido (-196ºC). - Liofilización. - Alternativos: transferencia periódica, suspensión en agua, desecación en papel, alginato, sal.

Cole Colecci cci cciones ones d de em micro icro icroorg org organ an anism ism ismos os - Aislados del hábitat natural y seleccionados. - Mejora genética. - Patentes y colecciones de “cultivos tipo” (ATCC, CECT). - Otras patentes y colecciones: plásmidos, genes clonados, vectores de clonación y de expresión.

DIAN DIANAS AS Características de una buena diana: dependen del objetivo final, y por lo tanto del tipo de compuesto que se busca. Así, una buena diana para un antibiótico debería ser: - Diana esencial. Papel fundamental en la fisiología celular. - Selectividad. No podemos bloquear una ruta esencial para bacterias, si esa misma ruta existe en humanos. En este caso dañaríamos tanto a la bacteria como al enfermo. - Accesibilidad. - Facilidad de ensayo. - Disponibilidad de información estructural. - Baja toxicidad.

Iden Identif tif tificaci icaci icación ón de d dian ian ianas as ter terap ap apéutic éutic éuticas as mic microb rob robian ian ianas as y en ensa sa sayos yos d de e crib cribado ado far farmacológ macológ macológico ico a ggran ran es escal cal calaa Requisitos de una diana de antimicrobianos: - Fisiológicos: Esencial para el crecimiento y supervivencia del patógeno. - Toxicidad selectiva: Sin homólogo en células humanas. Si lo que queremos es una levadura, una buena diana sería alguna proteína de su pared celular ya que las células humanas no tienen pared. La identificación de dianas se realiza mediante la bioinformática por genómica comparativa. Se puede realizar la mutagénesis por reemplazamiento génico. Los genes esenciales “potenciales” identificados en estudios de inactivación génica a gran escala en microorganismos patogénicos.

Est Estrate rate rategias gias pa para ra llaa ide identi nti ntificaci ficaci ficación ón de inhi inhibid bid bidore ore oress de la dia diana na Los inhibidores se buscan haciendo reaccionar una enzima y un sustrato. El sustrato puede ser inhibidor y entonces la reacción no dará lugar a ningún producto, o se pueden añadir distintos compuestos y observar cómo reacciona cada uno. Si uno de ellos es inhibidor no se producirá la reacción y no se producirá ningún producto. La desventaja es que para encontrar un inhibidor, hay que probar millones de compuestos. Aproximadamente unos 10.000 pueden dar cierta actividad. De estos compuestos muchos serán falsos positivos porque no reaccionan con el enzima sino con el sustrato. Se deben realizar ensayos más consistentes con cada uno de esos sustratos. La siguiente fase es el descubrimiento de los posibles fármacos. Se hacen ensayos con animales cuando ya solo contamos con 250 compuestos. Cuando se han seleccionado 5 compuestos, entramos en la fase clínica, en la que se intenta asegurar la no toxicidad y efectividad del fármaco. En esta fase se cuenta con voluntarios y dura unos 6 años. Consta a su vez de varias fases: - Primera fase: estudio de la toxicidad. Se realiza en 20-100 voluntarios. - Segunda fase: toxicidad y eficacia. Se lleva a cabo en 100-500 voluntarios. - Tercera fase: Si no se ha visto ningún problema, se pasa a la venta del producto. Se prueba en 1000-5000 voluntarios. En la siguiente etapa se aprueba y se comercializa el fármaco. Este proceso en total dura unos 15 años y cuesta unos 2000 millones de euros producir un fármaco. A pesar de esos costes, el número de fármacos nuevos no varía. En la actualidad no existe una única diana sino que lo que consideramos como diana está involucrada en una red completa. Por tanto, deben fabricarse tratamientos conjuntos que ataquen a esa red de dianas. Técn Técnicas icas p para ara llaa id identific entific entificación ación d de e med medicam icam icamentos entos

1. ELT: Partículas mezcladas con fragmentos de DNA que identifican la partícula. 2. HTS (Screening de alto rendimiento): Se realizan ensayos de millones de compuestos en reacciones enzimáticas a una gran velocidad. 3. Sistema fragmentado: no usa compuestos completos sino que analizamos bloques dentro de la estructura de un compuesto. 4. Diseño basado en la estructura: esta técnica se basa en que conociendo la estructura de una enzima podemos ser capaces de sintetizar una molécula con una estructura que encaje en el centro activo de la enzima. Esta técnica funciona en un porcentaje bajo ya que es muy difícil conseguir una estructura deseada. 5. Focussed screening.

Estr Estrateg ateg ategias ias p para ara la id iden en entific tific tificación ación d de e in inhib hib hibido ido idores res de la dian dianaa 1. Diseño racional a partir de la estructura de la diana: - Requiere conocimiento de la estructura tridimensional de la diana (purificación y cristalización) - Bioinformática. - Requiere conocimiento del mecanismo de acción molecular. - Síntesis química. - Elevadísima especificidad. Ej: inhibidores de la neuraminidasa del virus de la gripe. 2. Screening farmacológico: Colección de compuestos importante a la que comenzamos a hacerle ensayos específicos hasta llegar a una droga final. Si queremos identificar una proteasa en concreto, hacemos un ensayo general de proteasas y cuando hayamos disminuido el número de compuestos, vamos aumentando la especificidad de los ensayos para la proteasa que queremos. - Colecciones de compuestos: naturales o de síntesis química. - Química combinatoria o biosíntesis combinatoria.

HTS (High(High-thr thr through ough oughpu pu putt screen screening) ing) Se realizan de 10.000 a 100.000 ensayos al día. Características: - Diseño. Identificación de diana y tipo de ensayo. - Automatización. Robótica (dispensación). - Miniaturización. Alta densidad de pocillos y pequeño volumen (nanotecnología).

- Detección. Fluorescencia, quimioluminiscencia. Tipos de ensayo: - In vitro (bioquímico): Se utiliza un componente celular (enzima, receptor) como diana y se detecta: • La inhibición/activación enzimática mediante la variación de la concentración de sustrato/producto. • La interacción receptor-ligando (agonista o antagonista). - In vivo: se utilizan células vivas. Es una medida del efecto biológico de un compuesto sobre la célula (fenotipo) y la inhibición o recuperación del crecimiento o muerte celular. Las ventajas son: • Mantenimiento óptimo del microambiente de la diana. • Eliminación de inhibidores no activos sobre la célula entera (puede ser también desventaja). • Capacidad de detección de profármacos (al entrar en el organismo actúa como fármaco).

Tendencias actuales: - Miniaturización. Se ha miniaturizado todo. Las placas conservan su tamaño pero albergan muchos más pocillos (96-384-1536). Esto implica una miniaturización también del volumen de los líquidos a manejar. - Automatización/robotización. Todos los sistemas están automatizados para hacer las reacciones completas, es decir, se llevan a cabo todos los pasos que requiere la reacción. Para realizar la dispensación de los líquidos en los pocillos se utiliza un sistema denominado ecodispensación que consiste en disparar una onda de ultrasonido a partir de una placa madre, de tal manera que se produce el desprendimiento de una gota que por tensión superficial se adhiere al pocillo correspondiente en la placa de arriba. - Nuevos métodos de ensayo. - Captura y análisis de datos sobre la marcha....