taxonomia de microorganismos PDF

Preview

Summary

Download taxonomia de microorganismos PDF

Description

Teórico 15

MICROBIOLOGÍA

TAXONOMÍA La taxonomía es la parte de la ciencia que se ocupa de la clasificación. En microbiología, la taxonomía no es una ciencia estática sino que, conforme avanza la tecnología y se hacen nuevos descubrimientos, va cambiando y se va redefiniendo. La taxonomía microbiana incluye 3 áreas (o competencias) bien diferentes pero interrelacionadas entre sí: A. La clasificación: Organización de los organismos en grupos o taxones en función de sus semejanzas o de su parentesco evolutivo. B. La nomenclatura: Rama de la taxonomía que se ocupa de la asignación de nombre a grupos taxonómicos de acuerdo a normas pre-establecidas C. La identificación: Proceso de determinar que un aislamiento en particular pertenece a un taxón reconocido. La importancia de la taxonomía microbiana es: 

Organización de una alta cantidad de información.



Esencial para una correcta identificación.



Facilita la comunicación entre microbiólogos.



Permite realizar predicciones e hipótesis.

“Es el estudio científico de los organismos cuyo objetivo final es caracterizarlos y agruparlos de forma ordenada”.

CLASIFICACION El ribosoma de las bacterias es 70S y se puede desglosar en dos subunidades: la 50S y la 30S. A su vez, la subunidad 30S se puede seguir subclasificándose en tres porciones más pequeñas: 5S, 16S y 23S. La secuenciación del DNA ribosomal 16S fue el criterio utilizado para definir el último esquema de clasificación en tres dominios sin relación y con un ancestro común: Archaea, Bacteria y Eukarea. Actualmente se acepta que existen dos imperios y 7 reinos CATEGORÍAS O RANGOS TAXONÓMICOS 

Dominio



División



Clase



Orden



Familia



Género



Especie → es el rango taxonómico básico y más importante.

1

DIFICULTADES PARA DEFINIR UNA ESPECIE Si bien la especie es el rango taxonómico básico y más importante, en bacterias existen algunos problemas importantes para su definición, a saber: 

Diferencia con organismos superiores



Las especies procariotas se caracterizan por diferencias genotípicas y genotípicas

Hasta la actualidad no hay una definición exacta de los que es una especie microbiológica, pero la versión más difundida dice que una especie es un conjunto de cepas que comparte el 70% o mas de homología DNA-DNA, con un 5% o menos de ΔTm. RANGOS INFRASUBESPECÍFICOS Tipificar una cepa determinada significa identificar por debajo del nivel de la especie . Los rangos infrasubespecíficos son grupos de cepas que: a) no poseen nomenclatura oficial estandarizada y b) pueden distinguirse por algunas características especiales o distintivas (propiedades bioquímicas, propiedades antigénicas, propiedades patogénicas, capacidad de ser lisadas por un fago o características morfológicas).

PRINCIPALES CARACTERISTÍCAS O ELEMENTOS UTILIZADOS EN TAXONOMÍA A) Información fenotípica:

Clásicas: i) Información morfológica 

Características morfológicas de las colonias.



Forma y tamaño celular.



Comportamiento frente a tinciones.



Presencia de cilios o flagelos.



Forma y localización de las endosporas.

Las comparaciones morfológicas son valiosas debido a que las características estructurales dependen de la expresión de muchos genes, suelen ser estables desde el punto de vista génico, y normalmente no varian de forma sustancial con los cambios ambientales. La semejanza morfológica es un buen indicador de parentesto filogenético. ii) Información fisiológica y metabólica 2



Fuente de C y N



Fuente de energía



Productos de fermentación



Proteínas expresadas y marcadores quimiotaxonómicos (composición ácidos grasos, composición del peptidoglicano, etc.)



Rango de pH y pHopt



Rango de temperatura y Topt



Comportamiento frente a O2



Sensibilidad a inhibidores y ATB

Las características fisiológicas y metabólicas son de gran utilidad ya que están directamente relacionadas con la naturaleza y la actividad de las enzimas microbianas y las proteínas de transporte. Las proteínas son productos génicos, el análisis de estas características proporciona una comparación indirecta de los genomas microbianos. iii) Información ecológicas 

Preferencia de hábitat



Capacidad para causar enfermedad en el huésped



Necesidades de temperatura



pH



Concentración osmótica

Son características que afectan la relación de los microorganismos con su entorno. Incluso microorganismos estrechamente relacionados pueden diferir en forma considerable en relación con las características ecológicas.

Moleculares Composición de proteínas: La secuencia de aminoácidos de las proteínas son reflejo de las secuencias de ARNm y, por consiguiente están estrechamente relacionadas con la estructura de los genes que codifican para la síntesis. Las comparaciones entre proteínas de distintos microorganismos son de gran utilidad desde el punto de vista taxonómico. B) Información genotípica: 

Tamaño del genoma



Composición del genoma (%CG)



Hibridación DNA-DNA



Secuenciación del DNA → por ejemplo, la secuenciación del DNA que codifica para el RNA 16S se utiliza como "cronometro evolutivo" ya que sufre una baja tasa de mutación con el tiempo sin destruir ni alterar sus funcoines.



Perfiles de restricción → utilización de enzimas que cortan al DNA en lugares específicos.



Fingerprinting basado en PCR



Sondas de DNA 3

ALGUNOS CONCEPTOS IMPORTANTES %GC: El porcentaje guanina-citosina que tiene un acido nucleico (%GC): 

Puede ser determinado directamente por HPLC o indirectamente calentando el material genético, midiendo la absorbancia a 260 nm y determinando un parámetro denominado Tm.



Representa la cantidad de G y C (con respecto a las bases totales) que hay en dicha solución de acido nucleico. Es decir que %GC = (G+C)/(G+C+A+T).



Puede ser utilizado como criterio taxonómico: si bien en bacterias el rango varía entre 25 y 75%, no varía más del 3% dentro de especies bien definidas y no más de un 10% dentro de géneros bien definidos.

Hibridación DNA-DNA (también conocido como homología DNA-DNA): 

La hibridación DNA-DNA consiste en tomar las muestras de DNA que se desean comparar, calentarlas para romper los puentes de H y observar luego el grado de apareamiento entre las bases de las muestras.



Al igual que %GC, puede ser utilizado como criterio taxonómico: las cepas que pertenecen a una misma especie presentan gralmente 70% o más de hibridación u homología.

Las cepas que pertenecen a una misma especie generalmente presentan mayor o igual al 70% de hibridación.

SECUENCIACIÓN DEL DNA QUE CODIFICA PARA EL RNA 16S El estudio y la secuenciación del DNA que codifica para el RNA 16S fue el criterio utilizado para organizar al árbol filogenético universal en tres dominios no relacionados entre sí pero con un ancestro en común. ¿Por qué el DNA que codifica para el RNA 16S es un muy buen cronometro evolutivo? a) Está presente en todos los organismos. 4

b) La función es siempre la misma (formar parte de los ribosomas que luego intervienen en la síntesis proteica). c) Su secuencia se puede alinear en forma adecuada para poder comparar dominios altamente conservados y otros variables. d) Es una macromolécula que cambia con una frecuencia que guarda relación con la distancia evolutiva. Otras macromoléculas utilizadas para fines similares son las chaperonas, las histonas (solo en dominio Eukarea) y las HSP (heat shock proteins o proteínas de choque térmico). Las secuencias "signatura" son regiones de nucleótidos cortas, características de un determinado grupo o grupos de microorganismos, que se encuentran dentro del DNA que codifica para el RNA 16S. Existen secuencias "signatura" que definen a cada uno de los tres dominios primarios, aunque también pueden definir taxones principales dentro de cada dominio. Son útiles para situar a microorganismos desconocidos dentro de un grupo filogenético principal.

SISTEMAS DE CLASIFICACIÓN Una vez que se han recogido las características taxonómicas importantes de los microorganismos, estas se utilizan para construir sistemas de calsificacion. A) Taxonomía Clásica La taxonomía clásica mide varias características fenotípicas (no todas con el mismo peso o importancia) y luego se vale de ellas para la agrupación. De aquí surgen esquemas o llaves dicotómicas. B) Taxonomía Molecular Incorpora el análisis de los ácidos nucleicos a la taxonomía convencional. Las primeras determinaciones fueron %GC y la hibridación de DNA. C) Taxonomía Polifásica Es la taxonomía que se aplica en la actualidad ya que integra distintos tipos de datos e información (genotípica, fenotípica y filogenética). Es un tipo consensuado de taxonomía y lleva a la clasificación e identificación polifásica. D) Taxonomía Numérica La taxonomía numérica analiza un gran número de caracteres (aprox. entre 100 y 200) y a todos les da el mismo peso o importancia: el fin último es expresar en términos números las relaciones existentes entre los microorganismos. El coeficiente de semejanza "sj" se define como el cociente entre los caracteres presentes y la suma entre los caracteres presentes y diferentes (es decir sj = [caracteres presentes]/[caracteres presentes + caracteres diferentes]): mientras que un sj > 0.85 define una especie, un sj > 0.65 define un genero. 5

NOMENCLATURA Los microbiólogos asignan los nombres a los microorganismos mediante el sistema Binominal. Formado por el género y el epíteto especifico. Ambas partes determinan la especie.

IDENTIFICACIÓN El primer paso para poder identificar un microorganismo correctamente es partir de un cultivo puro. Luego se aplican criterios que van desde lo más general a lo más específico: esto último incluye la utilización de llaves dicotómicas, pruebas comerciales miniaturizadas, etc. En general, es suficiente contar con características fenotípicas y morfológicas. Para obtener un cultivo puro tiene que haber homogeneidad macro y microscópica en un medio no selectivo.

Pruebas Bioquímicas: TSI (agar Hierro-Triple azúcar) El medio TSI contiene 1 % de lactosa y de sacarosa y 0.1% de glucosa. El medio contiene rojo de fenol como indicador de pH para detectar la acidez como resultado de la fermentación 

Acidez = viraje al amarillo



Alcalinidad = viraje al rojo

También contiene sulfato amónico férrico y tiosulfato de sodio, a partir de estos compuestos algunas enterobacterias pueden producir SH2. Incubación tiempo dependiente ya que pasado el tiempo los resultados pueden variar. Fermentación de azúcares (glucosa, lactosa y sacarosa): 

Fermentación de glucosa : alcalino-ácido (estría roja y fondo amarillo)

 Fermentación de glucosa y lactosa y/o sacarosa: ácido-ácido (estría y fondo amarillo)  No fermenta ninguno de los tres azúcares alcalino-alcalino Producción de gas: se registra burbujas y/o ruptura y desplazamiento del agar. Producción de sulfhídrico: una reacción positiva implica el ennegrecimiento del medio de cultivo, por formación de sulfuro de hierro Citrato: Demuestra la capacidad de las bacterias de metabolizar el citrato. Contiene citrato como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de fosfato. Únicamente las bacterias capaces de utilizar citrato (capacidad que depende de la presencia de una citrato permeasa que facilita el transporte de citrato hacia el interior de la bacteria) podrán multiplicarse. Se genera una fuerte alcalinización del medio que será visible gracias al viraje del indicador (azul de bromotimol) al azul. Las bacterias citrato negativas no son capaces de crecer en este medio. Urea: Detecta la enzima que degrada la urea produciendo CO2 y amoniaco. La reacción es positiva cuando hay viraje del indicador al rojo por la formación de NH3 (alcalinización) por acción de la ureasa producida por el microorganismo. SIM Sulfhídrico: Una reacción positiva implica el ennegrecimiento del medio de cultivo por formación de un precipitado de SH2 Indol: Las bacterias que producen la enzima triptofanasa pueden hidrolizar el triptofano a indol, ácido pirúvico y amonio. Esta prueba es revelada en el medio SIM, al cual se le agregan el reactivo de Kovacs. Una reacción positiva se evidencia por la aparición de un anillo de color rojo en la superficie debido a la formación de un complejo entre el p-dimetil amino benzaldehido y el indol Motilidad: La motilidad es positiva cuando la turbidez producida por el desarrollo de los microorganismos se desplaza de la línea de siembra.

7

RM-VP El caldo RM-VP ya desarrollado (luego de 48 hs de incubación) se divide en dos fracciones ROJO DE METILOS: se revela por el agregado de tres gotas de la solución de rojo de metilo (indicador de pH), siendo positiva cuando se observa color rojo, debido a la acidez de la fermentación ácida mixta. VOGES PROSKAUER: Identifica las bacterias que producen 2,3-butanodiol como producto de la fermentación de la glucosa. Se revelada por el agregado de hidróxido de potasio al 40% y alfa-naftol al 5% en etanol absoluto. La reacción detecta la presencia de acetoina (acetilmetilcarbinol) que es un precursor del 2,3-butanodiol. La prueba es positiva cuando se desarrolla color rojo como resultado de la reacción entre la acetoína y los reactivos reveladores.

PARA IDENTIFICAR MICROORGANISMOS GRAM POSITIVO SE UTILIZAN DISTINTOS METODOS: Catalasa: Enzima que protege a las células frente al peróxido de hidrógeno producido en el metabolismo del oxígeno. Cataliza la formación de agua y oxígeno a partir del peróxido

de

hidrógeno.

Es

útil

para

distinguir

Streptococcus (negativa) de Staphylococcus (positiva) y Clostridium (negativa) de Bacillus (positiva). La actividad catalasa se detecta añadiendo unas gotas de peróxido de hidrógeno sobre las colonias en placa que no sea de agar sangre (daría falsos positivos). La producción de burbujas indica la presencia del enzima.

8

Coagulasa: La enzima coagulasa actúa directamente sobre el fibrinógeno, provocando la formación de coágulos que se producen al mezclar una suspensión bacteriana con plasma. Permite diferencia a los Staphylococcus aureus que dan una reacción positiva, del resto de los Staphylococcus. Se añade una suspensión densa de bacterias a un tubo pequeña con plasma y se incuba a 37°C. DNAsa: Se basa en la presencia de la enzima termoestable DNasa, que es capaz de clivar los enlaces internos fosfodiester de la molécula de ADN. Se realiza una estría gruesa en una placa conteniendo DNA. Se revela después de incubar con HCL 0,1 N que precipita el DNA no hidrolizado. Permite diferenciar al Staphylococcus aureusdel resto del género. ¿Por qué puede fallar una identificación? 

se parte de un cultivo que no estaba puro



se eligieron tests inapropiados (algunos cultivos viejos de bacterias Gram-positivas tiñen como si fueran Gram-negativas)



se eligieron métodos no controlados (siempre es recomendable trabajar con controles o blancos para evitar errores en el laboratorio)



se han utilizado mal las llaves o tablas

¿Cuáles son los errores más frecuentes en el laboratorio a la hora de identificar? 

aquellos relacionados con la forma



aquellos relacionados con la tinción de Gram



aquellos relacionados con la movilidad

En líneas grales existe poca dificultad para ubicar a un aislamiento en su género. COLECCIONES DE CULTIVO Son cultivos puros caracterizados correctamente. Utilizados como material de referencia en investigación, control microbiológico, propósitos biotecnológicos, etc. Las empresas encargadas de ellas preservan y distribuyen cepas microbianas descritas o citadas en publicaciones (ATCC = American Type Culture Collection; JCM = Japan Collection of Microorganisms, etc.).

9...