Tema 3.1. Polimerasas - Apuntes 3.1. PDF

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Tema sobre distintas formas de amplificación del ADN. Profesora Emilia Lopez Solanilla...

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TEMA 3.1. POLIMERASAS Las ADN polimerasas sintetizan una cadena nueva de ADN a partir de una hebra molde. Necesita un cebador con un extremo 3’-OH libre, llevando a cabo su actividad en sentido 5’→3’.

DNA polimerasas ADN polimerasa I de E. coli Holoenzima de 109 KDa aislada de Escherichia coli con tres actividades: •

Catalítica, lleva a cabo la polimerización de 5 a 3.

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Dos actividades exonucleasas, de 3’ a 5’ editora y de 5’ a 3’ que también puede degradar híbridos de DNA-RNA.

Se une al ADN de una sola cadena pero necesita que estén las dos complementarias formando un nick, el cual puede polimerizar a medida que degrada la cadena en sentido 5’→3’, reemplazando una de las hebras en un proceso conocido como nick translation. Si se introducen errores en la polimerización, la enzima puede volver hacia atrás y corregirlo.

Para que se lleve a cabo la reacción catalítica 5’→3’ necesita magnesio, dNTPs, un fragmento 5’ protuberante y un 3’ retraído. El sentido biológico de la actividad exonucleasa 5’ es eliminar los fragmentos de Okazaki utilizados para sintetizar la hebra retardada. Para esta actividad necesita un extremo 5’-fosfato. Esta enzima tiene distintas aplicaciones: -

Eliminación de extremos 3’ protuberantes en presencia de dNTPs, ya que sin estos, la actividad exonucleasa 3’→5’ seguiría degradando la hebra al no encontrar nucleótidos que añadir. La DNA polimerasa del fago T4 tiene una actividad exonucleasa mucho más potente que la DNA polimerasa I de E.coli.

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Relleno de extremos 5’ protuberantes, o 3’ retraídos y viceversa con dNTPs, obteniéndose extremos romos mediante la catálisis. En el caso de tener extremos 3’ protuberantes es necesario que primero actúe la actividad exonucleasa, de forma que tras ello pueda cebarse la enzima para polimerizar el fragmento restante.

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Marcaje de fragmento de DNA con 3’ protuberante o end labelling. En este caso solo se marca el extremo, ya que solo se incorporan dNTPs marcados en la pequeña retracción del extremo 3’ al llegar a la hebra complementaria. Síntesis de ADN ds o bicatenario en la construcción de genotecas de cDNA. Marcaje mediante Nick Translation.

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DNA polimerasa Klenow Es una versión modificada de la DNA polimerasa I. Si se trata con subtilisina, una subunidad se desliga del complejo, dejando libre el fragmento grande de la DNA polimerasa I o fragmento Klenow, de 76 KDa. Esta no tiene actividad exonucleasa 5’→3’ ya que pierde el fragmento. Además, mediante una mutación en un aspártico, la enzima pierde su actividad exonucleasa 3’→5’ editora.

Hay así dos tipos de DNA polimerasa Klenow, (+) si no tiene mutada la actividad 3’→5’; y (-) si tiene dicha actividad mutada. Normalmente se utiliza la polimerasa con su actividad exonucleasa normal, que tiene exactamente los mismos sustratos que la DNA polimerasa I, excepto los fragmentos 5’→3’. En determinados experimentos puede interesar que la enzima no elimine los primers que cebarán la actividad polimerasa, por lo que se utilizará el mutante (-).

Ingeniería Genética. Tema 3.1. Polimerasas

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Relleno total o parcial de extremos de dsDNA con extremos terminales 3’ retraídos.

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Marcaje de extremos DNAds con 5’ protuberantes. Recorte y marcaje de extremos 3’ protuberantes en DNAds. Síntesis de DNAds a partir de DNAss cebado. Se lleva a cabo un marcaje de sondas de DNA a partir de DNA cebado con una mezcla de oligonucleótidos, proceso conocido como random priming. Se lleva a cabo una mutagénesis dirigida in vitro y se secuencia el DNA.

DNA polimerasa T4 Enzima obtenida a partir de bacterias de E.coli infectadas por el fago T4. Posee dos actividades enzimáticas que requieren magnesio como cofactor: ➢ Catalítica en sentido 5’→3’. ➢ Exonucleasa editora en sentido 3’→5’, hasta 200 veces más activa que la misma actividad de la DNA polimerasa I. Es más eficiente frente a cadenas de ADN simple. Aplicaciones de la DNA polimerasa T4: -

Relleno de extremos de DNAds con extremos 3’ retraídos, con altas concentraciones de dNTPs para evitar que la actividad exonucleasa sobrepase la catalítica.

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Marcaje de dsDNA con extremos retraídos 3’, end labelling. Recorte y marcaje de extremos 3’ protuberantes, actuando primero la actividad exonucleasa; o extremos 3’ retraídos en un DNAds, con altas concentraciones de dNTPs para evitar la mayor actividad exonucleasa. Conversión de fragmentos de DNAds protuberantes en moléculas con extremos romos.

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DNA polimerasa T7 Enzima procedente de células de E.coli infectadas por el fago T7. Está conformada por una proteína p5 y una tiorredoxina de E.coli, de 12 KDa. Se une al complejo de replicación estabilizando la unión de la enzima con el DNA, aumentando la procesividad de esta. El tamaño medio del DNA sintetizado por una única molécula es más largo que el sintetizado por cualquier otra. Es más eficiente para polimerizar grandes fragmentos. Posee dos actividades: ➢ Catalítica en sentido 5’→3’. ➢ Exonucleasa en sentido 3’→5’, siendo más activa que la exonucleasa de la DNA polimerasa I. Aplicaciones de la DNA polimerasa T7: -

Elongación de cebadores o primer extension. Secuenciación con terminadores dideoxinucleotidos. Marcaje de extremos rellenando o cortando en extremos 3´.

Existen modificaciones de esta enzima llevadas a cabo mediante Ingeniería Genética, dando lugar a la SequenasaMR. Esta enzima modificada es más apta para secuenciar largos fragmentos de ADN además de no poseer la actividad exonucleasa.

DNA polimerasas dependientes de RNA Transcriptasa inversa, retrotranscriptasa, RTasa Enzimas que sintetizan moléculas de ADN utilizando ARN como molde. Algunas de ellas también dependen de DNA como molde. Necesitan magnesio como cofactor y oligonucleótidos como cebadores.

Aplicaciones de la retrotranscriptasa: -

Relleno y marcaje de terminaciones en ADN bicatenario con extremos 5’ protuberantes. Secuenciación de DNA con didesoxianalogos. Conversión de ssRNA en dsDNA, cDNA codificante. Síntesis de sondas a partir de moldes de ssDNA o RNA cebados.

Se utilizan como cebadores oligonucleótidos con una longitud de entre 12 y 18. Puede tratarse de secuencias aleatorias (random priming) o de secuencias definidas (primer extension).

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RNA polimerasas RNA polimerasa SP6 (de Salmonella typhimurium LT2 infectadas por el virus SP6) y RNAs polimerasas T7 y T3 (obtenidas a partir de bacterias de E.coli infectadas con los fagos T7 y T3 respectivamente) Estas enzimas, que no requieren cebadores para su actividad, requieren magnesio como cofactor además de un promotor específico. Llevan a cabo transcripciones para generar moléculas de RNA.

Aplicaciones de las RNA polimerasas. -

Síntesis in vitro de RNA. Elaboración de sondas, RNAs antisentido y RNAs funcionales en sistemas de traducción in vitro. Sistema de transcripción T7 empleado en la expresión controlada de genes clonados en E.coli.

RNA polimerasa de E.coli Utilizada para la transcripción in vitro con promotores adecuados. RNA polimerasa II del germen de trigo Enzima que reconoce secuencias promotoras de eucariotas, empleándose para estudios de transcripción de secuencias propias de estos organismos.

Otras actividades enzimáticas Fosfatasa alcalina e E.coli (BAP) y de intestino de ternera (CIP) Catalizan la eliminación de restos de fosfato que esterifican grupos OH en extremos 5’ de nucleótidos trifosfato y moléculas de DNA y RNA mono o bicatenarias.

Se utilizan para sustituir los fosfatos por fosfatos marcados en combinación con una quinasa. Además se utilizan para impedir la dimerización, circularización o polierización en procesos de obtención de ADN recombinante.

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Polinucleótido quinasa (PNK) del fago T4 Emplea como molde cadenas de DNA de una o de doble hebra fosforilándo los extremos, es decir, tiene una actividad contraria a la de la fosfatasa alcalina. Necesitan magnesio como cofactor y ATP como donador del grupo fosfato.

Se utiliza para marcar extremos 5’, desfosforilados previamente, de dsDNA, ya que estéricamente no fosforila los 3’. De esta forma permite construir sondas, definir mapas, estudiar la unión de proteínas a las secuencias de ADN (análisis de promotores), etc. La reacción del fosfato se produce en el grupo hidroxilo en el extremo 5’. También permite la fosforilación de oligonucleótidos sintéticos u otros cebadores carentes del grupo fosfato en el extremo 5’ para poder ser unidos a otros fragmentos. Desoxinucleotidil terminal-transferasa (dNTT) o transferasa terminal de timo de ternera Une nucleótidos en extremos 3’. En el medio de reacción ha de haber dNTPs que se puedan unir a los extremos 3’. No es una DNA polimerasa al no necesitar un molde. Necesita magnesio o cobalto como cofactores, pudiendo añadir nucleótidos en ssDNA o dsDNA. Es capaz de unir nucleótidos cuando en una doble hebra de ADN el extremo 3’ está retraído o se forman romos, con una tendencia a la complementariedad, aunque puede no añadir el nucleótido correcto, dando lugar a una desestabilización de la molécula. Puede unir varios millares de dNTPs, pudiendo usar dideoxiNTPs o NTPs como terminadores. Aplicaciones: -

Permite la creación de colas de homopolímeros (Tailing). Al añadir un solo tipo de dNTPs, la enzima los incorporará continuadamente. De esta forma se tiene una cola donde cebar a una polimerasa para amplificar una secuencia desconocida.

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Marcaje de extremos 3’ de un DNA por incorporación de dNTPs, ddNTPs o NTPs marcados.

Poli (A)-polimerasa de E.coli Enzima que actúa sobre RNA de cadena sencilla. Necesita la presencia de ATP y solo es capaz de incorporar este nucleótido creando colas poli A en extremos 3’-OH. Necesita magnesio como cofactor e incorpora AMP.

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Se emplea en el marcaje de moléculas de RNA por adición de una cola de nucleótidos marcados y para crear colas de Poli-A en moléculas de RNA para cebar a la polimerasa con un oligo dT, sintetizándose cDNA. Guanidil transferasa de S.cerevisiae Enzima con tres actividades distintas, consiguiendo incorporar CAPs (caperuzas de metil-guanosina-trifosfato) en extremos 5’ de RNA trifosforilado, siendo muy útil para experimentos de traducción in vitro y para ser traducidos en sistemas eucarióticos. Primero actúa la actividad trifosfatasa, que elimina un fosfato del extremo 5’ trifosforilado. Tras ello, la actividad transferasa incorpora la guanina, para lo que se vale del GTP como sustrato. Por último se lleva a cabo la metilación, para lo que se utiliza S-adenosilL-metionina como sustrato, concluyendo la formación del CAP.

Metil transferasas -

Sistemas de restricción-modificación bacterianos. DAM metilasa. DCM metilasa.

Bloquean la rotura de dianas específicas para la construcción de moléculas recombinantes empleando linkers o adaptadores, moléculas de DNA.

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