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4º C. Biomédicas (UdL) Irene LV

BIOLOGÍA DEL DESARROLLO Y MEDICINA REGENERATIVA Tema 7. Gastrulación y la especificación axial en vertebrados II 7.1 La gastrulación en las aves 7.2 La gastrulación en los mamíferos 7.3 Homólogos del organizador de Spemann, Nódulo de Hensen y genes del nódulo 7.4 La generación del eje antero-posterior 7.5 Bases moleculares de la especificación del eje izquierda-derecha

7.1 La gastrulación en las aves Los seres humanos gastrulan de forma muy similar al pollo (Gallus gallus) Cuando se observa el epiblasto del embrión de pollo encontramos la primera similitud con el embrión humano y es que ambos son planos. Como vemos en la imagen el embrión, que se encuentra “flotando” sobre la yema del huevo tiene un área opaca, el área pelúcida y un área más

densa con forma de hoz conocida como la hoz de Koller. En la siguiente imagen podemos observar cómo se ve en realidad:

Si hacemos un corte transversal del disco vemos que en realidad el epiblasto es una monocapa de células, que es el epiblasto, que están flotando y que entre la yema y el epiblasto hay una cavidad, el

espacio subgerminal . En la zona más densa, la zona posterior marginal, hay una acumulación de células. A partir de la monocapa (del epiblasto) se desarrolla una estructura que permite gastrular: se pasa de tener una monocapa de células a un disco cerrado, que permite que las células pasen por el agujero (primitive streak) y “no caigan”.

Cuando se pone el huevo está formado por unas 20.000 células (área pelúcida) envueltas por el área opaca y comienza a haber una delaminación de algunas células del epiblasto que inician la formación

del hipoblasto. Primero comienzan a descamarse células del epiblasto que forman los islotes de poli-invaginación que comenzarán a formar el hipoblasto. De esta manera tenemos el grupo de células del área opaca o zona marginal y en lo que era la cavidad del espacio subgerminal los islotes de células.

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Biología del desarrollo y medicina regenerativa

En el esquema que tenemos a continuación también se ve cómo se vería esta migración desde un “plano ventral”.

En la zona posterior se forma la hoz de Koller, anterior al área opaca , que continúa la formación del

hipoblasto. De la hoz de Koller van descamándose células que son atraídas a los islotes que secretan moléculas señalizadoras que atraen a las células que van saliendo del hipoblasto. Estas células se unen a los islotes de manera que se va cerrando el disco.

A medida que el hipoblasto se mueve anteriormente (ya que la migración de células se produce desde anterior a posterior), el epiblasto se concentra por encima de la hoz de Koller para formar el primitive

streak.

Si hacemos un corte para observarlo al microscopio, como se ha hecho para obtener la imagen siguiente, podemos ver la yema en la parte inferior de la imagen y el hipoblasto que ha comenzado a formase (hoz de Koller) y está siendo atraído por los islotes de poli-invaginación. La hoz de Koller (KS en la imagen – Koller’s sickle) es la zona más densa y más opaca, de la que se origina el hipoblasto. El hipoblasto es una capa de células. *(hipo  abajo; epi-  arriba)

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A partir de este disco cerrado se produce la gastrulación. Una vez se cierra el disco, el primitive streak crece hacia anterior y las células van desplazándose hacia él a medida que avanza gracias al movimiento de embolia. Como ya hemos ido viendo, el tejido que dará lugar al telencéfalo no atraviesa el primitive streak.

El endodermo acaba sustituyendo al hipoblasto a medida que atraviesa el primitive streak y el

mesodermo, que en teoría pasa más tarde, se coloca sobre este. En el esquema podemos ver cómo el hipoblasto está siendo desplazado por el endodermo y que el futuro ectodermo acaba quedándose alrededor del primitive streak. El endodermo termina sustituyendo a todo el hipoblasto y el mesodermo queda en el medio, entre el endodermo y el ectodermo. A continuación tenemos un corete de microscopía electrónica de rastreo que ha sido coloreada. El epiblasto se ve en la imagen en la parte superior, de color negro, que se está rompiendo y descamando. El mesodermo está pintado de rojo y el endodermo se localiza en la parte de abajo, de color amarillo.

7.2 La gastrulación en mamíferos (humanos) En la secuencia de la imagen vemos que en 7 días (del día 13 al 20) se pasa de tener un disco en el que comienza a aparecer el primitive streak a tener un embrión con las tres capas germinales ya formadas y posicionadas en el que ya se puede apreciar la estructura que se va a ir desarrollando (ya se intuye dónde se situará el telencéfalo).

7.3 Homólogos del organizador de Spemann. El nódulo de Hensen y los genes del nódulo 3

Biología del desarrollo y medicina regenerativa Mientras que en Xenopus laevis hablamos de organizador de Spemann y Mangold (SMO), en organismos amniotas hablamos de nódulo de Hensen. El nódulo de Hensen, al igual que el organizador de Spemann secreta inhibidores por lo que, las células que no atraviesan el primitive streak (futuro ectodermo), además de no recibir el estímulo por no atravesarlo reciben todos los inhibidores. Para saber si el nódulo de Hensen tiene la misma función que el organizador de Spemann y Mangold se pueden diseñar experimentos similares a los que ya hemos visto en Xenopus. Se trasplanta un nódulo de Hensen de faisán en un embrión de pollo (se cogen dos especies para poder seguir su recorrido) y se obtiene un embrión con una pseudoneuralización secundaria inducida por el nódulo trasplantado.

7.4 Generación del eje antero-posterior Mus musculus En ratón nódulo de Hensen (organizador) queda desplazado a un lado y el endodermo anterior visceral o AVE es el organizador neural. Como ya se ha comentado, el AVE secreta inhibidores que inhiben Wnt,

Nodal y BMP4 (que llega desde abajo o distal). Wnt, Nodal y BMP4 no son inhibidos en la parte posterior del embrión pero sí se inhiben en anterior, que es donde se desarrolla el tejido neuronal (se inhiben todos los morfógenos). El eje anteroposterior se genera gracias a la inhibición en la región anterior, que promueve que las señales de los morfógenos Wnt,

Nodal y BMP4 posterioricen (señalizan en la parte posterior). La creación de la zona anterior (mediante la inhibición) ya implica la formación del eje.

7.4 Bases moleculares de la especificación del eje izquierda-derecha 4

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En el interior el organismo adulto presenta asimetrías que se producen durante el desarrollo.

¿Qué hace que seamos asimétricos? Lo primero que se observó respecto al desarrollo de las asimetrías en vertebrados es que nódulo de Hensen tiene en un lado (derecho) receptores de activina (ActvRIIa) mientras que en el otro lado (izquierdo) del embrión hay activación de Sonic HedgeHog (Shh).

Si contamos con un embrión abierto podemos hacer pruebas para estudiar qué ocurre, en concreto, tras observar que existían zonas de no tolerancia entre los morfógenos activina y Sonic HedgeHog, interesaba estudiar si es la activina la que inhibe Shh o si es a la inversa. Para ello utilizaron beads con los morfógenos que introdujeron en el interior del embrión (está abierto). Al añadir Activina vieron que se activaban los receptores y se inhibía Shh tanto si la activina se añadía en el lado derecho (que es el que le corresponde) como en el izquierdo. Hipotetizaron que la activina hace que se activen los

receptores y que se inhibe Shh. Más tarde se comprobó que es el gradiente diferencial de

Activina y Sonic HedgeHog lo que permite tener el eje izquierda-derecha.

Actualmente se saben más cosas sobre estos morfógenos y la aparición del eje. La señal inicial en el lado derecho es la Activina β que activa los

receptores que mantiene inhibido Sonic HedgeHog. Mientras, en el lado izquierdo es Sonic HedgeHog el morfógeno que se mantiene activo y no hay señalización por activina.

Qué ocurre downstream en las vías de señalización activadas por Activina y Sonic HedgeHog 5

Biología del desarrollo y medicina regenerativa En el lado izquierdo actúa Sonic HedgeHog (Shh) que promueve la señalización de Nodal y Lefty y lo que es más importante, activa Caronte. Caronte es un inhibidor que inhibe la vía BMP4. Como tenemos BMP4 inhibido, Nodal es libre activo y estimula al factor de transcripción Pitx2, que se expresa por tanto solo en el lado izquierdo. Por otro lado, la inhibición de BMP4 impide la inhibición de Lefty por parte de este y Lefty actúa inhibiendo Nodal . Es decir, se activa Lefty como subproducto de Nodal activándose de esta manera un bucle de retroalimentación negativa. En el lado derecho del cuerpo hay señalización por Activina que induce FGF8, un represor de Caronte. De esta manera se bloquea toda la vía que está activa en el lado izquierdo y BMP4 se mantiene activo. BMP4 bloquea la vía Nodal. Además se produce la expresión de Snail. Por tanto, en los dos lados del cuerpo hay dos vías que tienen en común al inhibidor Caronte.

Si hacemos una in situ contra las proteínas de la vía podemos observar Nodal, Lefty y Pitx2 en el lado derecho (la expresión de Pitx2 es más global).

¿Cómo es posible mantener una expresión tan localizada en un solo lado del embrión? Ya hemos visto que los inhibidores constituyen un elemento clave para la asimetría pero cómo se consigue que los inhibidores se queden a un lado o al otro del organizador. La localización precisa de los inhibidores en el lado que les corresponde se consigue gracias a los cilios. Los morfógenos Inversina, Kif3 y Polaris participan en la formación de los cilios y si se produce algún problema durante la ciliogénesis habrá problemas en la organización izquierda-derecha del individuo. Por ejemplo, en un mutante para la cohesina Kif3 no se genera bien el eje por problemas en la formación de cilios. 6

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Mediante la microscopía electrónica de escaneo podemos ver que en realidad el organizador o nódulo

de Hensen está cubierto de cilios que, con su movimiento sincronizado, generan una corriente que desplaza los morfógenos hacia un lado o hacia el otro. Cuando se secreta un morfógeno como Nodal de las células del organizador, los cilios que lo recubren se mueven haciendo que toda la cantidad de morfógeno se desplace hacia el mismo lado del organizador creando de esta manera los gradientes de morfógeno. Para estudiar este fenómeno se pone el embrión en una suspensión de partículas marcadas con fluorescencia y se observa que todas las partículas van hacia el mismo lado del nódulo, al igual que ocurre con los morfógenos. Como la inversina, Kif3 y Polaris determinan la formación de los cilios, cualquier defecto en estas moléculas hará que la creación de estas corrientes

sea deficiente. En este caso podrían darse varias situaciones, por ejemplo los morfógenos pueden permanecer en la zona del nódulo, o bien pueden distribuirse al lado opuesto al que deberían.

Problemas en la formación del eje izquierdaderecha

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Biología del desarrollo y medicina regenerativa La situación normal y deseable de asimetría se conoce como Situs solitus. Es decir, tenemos el corazón en el lado izquierdo, un pulmón a cada lado siendo el izquierdo más pequeño por la posición del corazón, bazo y estómago en el lado izquierdo e hígado en el lado derecho. Cuando hay isomerismo derecho el hígado se duplica y se distribuye hacia los dos lados (en lugar de quedarse en el lado derecho). La proporción del corazón cambia ya que también se duplica y se mantiene en el centro del cuerpo, lo que implica que los pulmones se vuelven simétricos. Además el bazo desaparece y el estómago reduce su tamaño. En caso de isomerismo derecho el bazo se duplica, el estómago se coloca en el lado derecho y el hígado queda casi marginal. El Situs inversus ocurre cuando se forman los ejes al revés y no tiene por qué ocasionar ningún problema al individuo ya que las estructuras son iguales pero localizadas en el lado contrario. Puede suponer una dificultad a la hora de asociar síntoma y enfermedad. En el caso de las estructuras que se forman a partir de un tubo, si se doblan hacia el lado que no corresponde se formará la estructura solo hacia un lado.

Para desarrollar el bazo por ejemplo se generan dos estructuras simétricas, una a cada lado del cuerpo, y una de ellas sufre una regresión (la del lado derecho).

También hay estructuras que crecen de manera diferencial en forma de lóbulos, como es el caso de los pulmones.

DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS MADRE La embriología ha permitido muchos avances en el campo de las células madre (Stem Cells). Todos los conocimientos que se tienen de embriología se pueden aplicar a las células madre: cómo a partir de una célula pluripotente se pueden obtener un gran número de células diferentes que proceden de una misma capa germinal. Como ya sabemos, si las células reciben una dosis de activina se obtendrán los precursores del endodermo. En cambio, para obtener los precursores del mesodermo las células necesitan recibir

activina y BMP4. Para tener células del sistema nervioso habrá que añadir inhibidores de Nodal, de activina y de Wnt. 8

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Inducción neural

Para desarrollar neuronas a partir de células madre hay que añadir los inhibidores (cordina. Inhibidores de Wnt y de BMP4, …) aunque basta con dejarlas libres de cualquier morfógeno para que se active el programa neuronal por defecto. Obtenerlas sin añadir ninguna molécula se ha conseguido plantado a muy baja densidad : como hay pocas células, los morfógenos que puedan ir produciendo

no afectarán si se cambia el medio (o bien si se añaden inhibidores). A continuación vemos el seguimiento de un experimento en el que se han dejado las células crecer sin morfógenos: En el día 3 se produce una apoptosis masiva y se seleccionan las células. A día 4 ya se obtiene cierta

morfología neuronal.

Los precursores neuronales se agrupan en una placa formando estructuras que se llaman rosetas (ya que tienen forma de flor) que dejan un espacio en el centro.

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Biología del desarrollo y medicina regenerativa Se puede conseguir que los precursores se dividan. En ese estadio también se pueden congelar y mantener indefinidamente. Si se dejan dividir indefinidamente y se mantienen hasta que se diferencian se pueden mantener neuronas diferenciadas.

Para identificar estas células hay marcadores específicos: la nestina (marcada en verde en las imágenes) marca las células ya diferenciadas y la β-3-tubulina marca las indiferenciadas. Estas neuronas, además de diferenciarse se pueden integrar y formar sinapsis si se inyectan en un cerebro ya que se distribuyen por el córtex.

Las células humanas son, en general, más lentas para todo. El proceso de diferenciación es más largo y los protocolos durante entre 35 y 37 días. En el caso de las células humanas, para poder acortar este proceso, se las ayuda mediante inhibidores: Noggin y un inhibidor de Nodal (SB431542). Al inhibir Nodal y BMP4 se consigue una diferenciación en un tiempo de 7 días. En el primer día las células presentan marcadores de células pluripotentes pero vemos que a día 7 ya presentan marcadores de células diferenciadas.

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Inducción de la epidermis Para casos de grandes quemados generar células de la epidermis para reemplazar las regiones de piel quemadas podría tener utilidad. No se aconseja realizar este tipo de procedimientos para los quemados ya que la ingeniería tisular en la epidermis ha progresado mucho, por lo que es posible trasplantar las células de la epidermis del propio paciente sin necesidad de trabajar con células madre (lo que resulta más económico y más sencillo). En Xenopus laevis tenemos, como ya sabemos, un centro organizador del que salen los inhibidores. El tejido junto al organizador dará lugar al tejido neuronal (neuroectodermo) ya que no recibe ningún

morfógeno y los tejidos que sí reciben morfógenos darán lugar a endodermo y mesodermo (reciben mucha señalización por Nodal). Junto al futuro neuroectodermo hay un conjunto de células a las que no llega Nodal desde la parte anterior pero que, al localizarse más alejado del organizador , la inhibición no es lo suficientemente fuerte para evitar que reciban señal de BMP4. Estas células que reciben cierta señal de BMP4 son las que darán lugar a la epidermis. Es decir, la parte que dará lugar al epitelio no recibe ningún morfógeno durante la gastrulación salvo al final del proceso que es cuando recibe algo de BMP4. En ratón ocurre lo mismo aunque es el AVE el principal encargado de secretar los inhibidores junto al ectodermo.

Por tanto, para diferenciar células de la epidermis a partir de células madre deben cultivarse las células

sin ningún morfógeno (tampoco inhibidores) y añadir al final de la diferenciación BMP4. Aparecen los marcadores de células epiteliales. Cuesta unos 3-4 días obtener las células epiteliales diferenciadas.

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En la siguiente imagen vemos que es posible conseguir incluso un epitelio pseudoestratificado que podría implantarse en humanos. Aunque como ya hemos comentado no merece la pena ya que se pueden obtener las células del propio paciente.

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