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CÁTEDRA "B" DE CITOLOGÍA, HISTOLOGÍA Y EMBRIOLOGÍA Autor Responsable: Prof. Marhta VIDA

F.C.M

U.N.L.P.

Diseño y Edición Pablo DEGREGORI

OBJETIVOS DE LA MATERIA Formar un estudiante que posea conocimientos de Citología, Histología y Embriología en un nivel adecuado y suficientemente actualizado, capaz de interpretar los fenómenos dinámicos de la Histofisiología y del desarrollo embriológico del hombre. Desarrollar en el alumno la capacidad de observación, de análisis y síntesis, de comparación y de crítica, para poder resolver los problemas que se le planteen. Así se podrá llegar, mediante la discusión inteligente y bien fundamentada, a un conocimiento más sólido y perdurable. Contribuir a una profunda formación científica general, preparando al estudiante para saber categorizar los valores éticos y desarrollar el sentido de la responsabilidad.

HISTO: tejido LOGOS: estudio, palabra o aprendizaje. El fundamento de nuestras actividades prácticas, será familiarizar a los alumnos con el estudio microscópico de las estructuras normales, de los distintos órganos de la economía; interrelacionarlos interrelacionarlos; comprender sus funciones (Fisiología) y concluir en la posibilidad de que existan alteraciones morfológicas y/o funcionales, de los mismos (Fisiopatología), intentando capacitarlos para su futura introducción al estudio de las enfermedades (Patología), las cuales se expresan mediante signos y síntomas que se estudian en la Clínica Médica. Toda metodología didáctica que nos permita concretar lo fundamentado anteriormente, será valida.

TÉCNICA HISTOLÓGICA Con más de cien años de existencia, se ha ido perfeccionando con el paso del tiempo. Esta técnica debe estudiar una capa muy delgada de la muestra, susceptible de ser observada, por transparencia, en el microscopio, conservando: 1. La forma y tamaño, lo más exactamente posible. 2. La estructura de las células y los tejidos. Para conciliar estas dos exigencias, las piezas a estudiar deben sufrir un cierto número de procedimientos, que comprenderán ciertas etapas o pasos. Para ello proponemos a los alumnos, las siguientes Unidades de Acción: A. Nombre los pasos de la Técnica Histológica, para el examen mediato (Técnica Corriente) B. En la obtención de material, discuta la diferencia entre Necropsia y Biopsia. C. Nombre los animales de laboratorio mas comúnmente utilizados, para la obtención de material de estudio. D. Explique la importancia de la fijación. E. Dé ejemplos de Fijadores Físicos, Fijadores Químicos y Mezclas Fijadoras más comunes. F. Nombre el Fijador Químico más común. G. Establezca la importancia de la INCLUSIÓN. H. Mencione la sustancia que se usa comúnmente para la inclusión y los pasos utilizados para la misma. I. Mencione el espesor de los cortes que se utilizan en microscopia óptica; compárelos con el espesor exigido en microscopia electrónica. ® Cátedra “B” de Citología, Histología y Embriología. Facultad de Ciencias Médicas. U.N.L.P. 2017. Reserva de derechos. Quedan reservados todos los derechos de propiedad intelectual, diseños e imágenes contenidas en estas páginas. Queda totalmente prohibida cualquier copia o reproducción total o parcial de dicha edición por cualquier medio del contenido sin la autorización previa, expresa y por escrito de la Cátedra.

CÁTEDRA "B" DE CITOLOGÍA, HISTOLOGÍA Y EMBRIOLOGÍA – F.C.M. – U.N.L J. Explique brevemente el montaje. K. Se discutirá, en forma practica, la orientación de los cortes. Los diferentes planos en que pueden ser cortados: Célula-Órgano Hueco-Órgano Macizo. L. Defina qué es un Colorante. M. Establezca la diferencia entre Coloración e Impregnación. N. Dé ejemplos de los colorantes más utilizados. O. Establezca diferencias y relaciones entre los siguientes términos: BASÓFILO ACIDÓFILO (EOSINOFILO) ESTRUCTURA BASICA ESTRUCTURA ÁCIDA P. Mencione la Coloración Dicrómica, más común; analice sus pasos. Q. Nombre algunas técnicas Tricrómicas. R. ¿Qué entiende por Metacromasia? S. Mencione algún Colorante Metacromático. Nuestra Cátedra de Citología, Histología y Embriología tiene como principal objetivo a lo largo y a través de nuestras actividades practicas, orientar a cada estudiante a comprender la microanatomía de las células, los tejidos y los órganos que ellos constituyen, pudiendo así correlacionar la estructura y la función. El estudio directo de células y tejidos vivos solo tiene aplicaciones limitadas, presentando los tejidos, en este estado, cierto espesor que dificulta el paso de la luz a través de ellos. Por lo que se utiliza con mayor frecuencia el estudio de tejidos muertos obtenidos por biopsia o necropsia (autopsia) y mantenidos a través de diversas acciones químicas, a las que son sometidos de forma inmediata a su extracción. El material se ha obtenido en algunos casos por biopsia, por ejemplo: piel, pero en mayor número por necropsia de animales de laboratorio (rata, perro, gato, conejo, mono, etc.) o del hombre. Puede tratarse de: un órgano entero o mas comúnmente un trozo o fragmento del órgano. Siempre se realiza con instrumental quirúrgico y con el debido conocimiento anatomotopográfico.

De las diversas acciones químicas para preparar y preservar este material de estudio, el primer paso esta marcado por la acción fijadora de ciertos agentes químicos (individuales o mezclas). Los fijadores conservan la estructura de las células y de los componentes extracelulares deteniendo el metabolismo celular, es decir, frenando la autólisis y estabilizando las proteínas. El fijador químico individual mas utilizado es el formol, solución acuosa de formaldehído al 37%, el formol es un mal fijador de las membranas plasmáticas pues no reacciona con los lípidos. La mezcla fijadora mas utilizada es la de Bouin (formol, ácido acético y ácido pícrico). Si bien no los utilizamos en el material que examinamos en nuestros trabajos prácticos, recordemos que también hay fijadores físicos: frío, calor, congelación y desecación. El segundo paso es infiltrar o incluir la muestra con la finalidad de permitir cortes muy delgados y la sustancia de inclusión empleada es la parafina debido a sus condiciones de penetrabilidad y consistencia. Por lo tanto al retirar la muestra de la solución fijadora, se deberá lavar y luego: a) deshidratar lenta y progresivamente en soluciones alcohólicas de concentración creciente: 70% - 80 a 90% - hasta llegar al alcohol absoluto (100%). Se quita el agua de células y tejidos que componen la muestra, porque la parafina no será miscible ni en agua ni en alcohol. b) se procederá luego a la aclaración utilizando un solvente orgánico como el xileno, miscible tanto en alcohol como en parafina, por lo tanto es reemplazado el alcohol absoluto. Finalmente sobreviene la imbibición en parafina fundida (estufa a 60º), que deberá ocupar todos los espacios entre las células y en el interior de las mismas. Al retirar de la estufa la parafina fundida, se enfría y endurece formando un bloque de tamaño adecuado: taco, el cual se coloca en aparato de gran precisión, provisto de una cuchilla de acero: Micrótomo, el mismo se encargará de efectuar cortes lo suficientemente delgados (5-10 μm de espesor) que permitan el paso de la luz a través de ellos.

MICROSCOPÍA Y TÉCNICAS DE ENFOQUE – H1 Para acceder a la tercera etapa que es la coloración, observar el corte histológico al microscopio óptico y examinarlo en detalle, habrá que disolver y extraer la parafina utilizando nuevamente al xileno. Procediendo luego a la rehidratación de los tejidos mediante el uso de soluciones alcohólicas de concentración decreciente (100% - 90% - 70%). Los cortes o muestras se colorean, se colocan en concentraciones crecientes (90-100) de soluciones alcohólicas para su deshidratación y se montan con bálsamo de Canadá, al cual se le adhiere un cubreobjeto. La composición química de un tejido vivo es muy diferente a un tejido muerto que ha pasado por la acción de agentes fijadores y de otras reacciones químicas posteriores. Perduran tras la fijación, macromoléculas que no se disuelven con facilidad: nucleoproteínas, proteínas del citoesqueleto, proteínas extracelulares, componentes de la membrana celular. Pero hay otras macromoléculas que se pierden si el fijador está en solución acuosa, como: glucógeno, proteoglucanos y GAG. De las técnicas de coloración empleadas en la cátedra para la enseñanza, la más frecuente es la coloración dicrómica con hematoxilina y eosina (H y E): la eosina es un colorante ácido de carga neta negativa en su parte coloreada (aniónica) la hematoxilina es un colorante básico de carga neta positiva en su parte coloreada (catiónica). Aunque no es estrictamente un colorante básico, tiene propiedades tintoriales muy semejantes a las anilinas básicas..

Reaccionan con

Grupos catiónicos: (carga +) Proteínas básicas del citoplasma.

Acidofilia = capacidad de tinción de los colorantes ácidos

ROSADO

EOSINA Colorante Ácido o acidófilo de carga (aniónico)

AZUL

Basofilia = capacidad de tinción de los colorantes básicos

ACIDOFILIA

Reaccionan con

Grupos aniónicos: (carga -): - fosfatos de los ácidos nucleicos. - sulfatos de GAG (glucosaminoglucanos) - carboxilo de las proteínas.

BASOFILIA

HEMATOXILINA Colorante básico o basófilo de carga + (catiónico)

También se incorporan en los trabajos prácticos aunque en menor número, cortes histológicos teñidos con técnicas tricrómicas tales como: a) de Gomori: Hematoxilina (básico), color azul violáceo. Crosmotropo (ácido), color rojo. Verde luz (ácido), color verde. b) de Azán:

Azocarmín (básico), color rojo. Azul de anilina (ácido), color celeste. Orange G (ácido), color naranja.

Hay diversas variantes de Azán, una de ellas es el Mallory (Mallory-Azán) con tres colorantes ácidos: orange G, azul de anilina y fucsina ácida. Con la técnica del PAS (ácido Peryódico-reactivo de Schiff), que tiñen de color rojo púrpura: carbohidratos (glucógeno, glucoproteína, GAG, etc). Mostramos en trabajo práctico un corte de hipófisis (glándula endocrina), la membrana basal de los cordones epiteliales secretores e incluso algunas células secretoras de hormonas glucoproteicas. Con la impregnación argéntica los tejidos son tratados con sales metálicas (de plata) produciéndose un precipitado al ser enfrentadas dichas sales a un agente reductor. Con esta técnica mostramos fibras reticulares como sostén o estroma en un ganglio linfático y también en la observación de células de la neuroglia, en cortes de órganos del sistema nervioso central.

CÁTEDRA "B" DE CITOLOGÍA, HISTOLOGÍA Y EMBRIOLOGÍA – F.C.M. – U.N.L La inmunohistoquímica nos permite reconocer células del páncreas endocrino y células de la adenohipófisis, son técnicas muy específicas que mostramos ocasionalmente en nuestras actividades prácticas. El organismo reacciona ante sustancias extrañas (antígenos) y forma anticuerpos (proteínas específicas) que sintetizan y secretan células del tejido conectivo (plasmocitos). En el laboratorio un anticuerpo se conjuga o une químicamente a un colorante fluorescente por ejemplo fluoresceína, este reactivo se aplica a cortes de tejidos fijados débilmente y luego colocados sobre portaobjetos y detectan al antígeno en células y tejidos (los hace visibles). La especificidad de la reacción entre el antígeno (Ag) y el anticuerpo (Ac), es el fundamento de la inmunocitoquímica. Además de esta técnica de anticuerpo fluorescente, se puede utilizar otra técnica como la histoquímica enzimática, en la cual al anticuerpo se le adosa la enzima peroxidasa (en lugar de la fluoresceína), pudiéndose identificar complejos antígeno-anticuerpo mediante la determinación enzimohistoquímica de la peroxidasa, fundamento de algunos cortes de tejido glandular endocrino que incorporamos en trabajos prácticos. Los microscopios son los instrumentos que permiten identificar las características generales y particulares de: células, tejidos y órganos. Aumentan el tamaño de una imagen lo cual permite ver detalles de la misma, imposibles de observar a simple vista. Existen muchos tipos de microscopios como por ejemplo:

MICROSCOPIOS ÓPTICOS SIMPLE SIMPLE: Lupa COMPUESTOS, DE LUZ O DE CAMPO CLARO CLARO: la muestra se observa más oscura que el campo que la rodea (son los que se utilizan en el aula de trabajos prácticos). ESTEREOSCÓPICOS ESTEREOSCÓPICOS: permiten ver las muestras en dos y tres dimensiones. DE LUZ ULTRAVIOLETA ULTRAVIOLETA: la imagen depende de la absorción de la luz UV, por las moléculas de la muestra. DE LUZ POLARIZADA POLARIZADA: presenta modificaciones del M/O: entre la fuente de luz y la muestra se coloca un filtro (polarizador) y entre el objetivo y el observador un segundo filtro (analizador). DE CAM CAMPO PO OSCURO OSCURO: para observar microorganismos; tiene un condensador especial que hace que los rayos luminosos no penetren directamente sino en forma oblicua, es decir la luz se dispersa o refracta por las estructuras del espécimen. DE CONTRASTE DE FASES FASES: se utiliza para células vivas, es decir en cultivos. Se basa en modificaciones de la trayectoria de los rayos de luz, provocando contrastes notables en la preparación. DE FLUORESCENCIA FLUORESCENCIA: el material biológico es tratado con flurocromos, emite luz propia. CONFOCAL DE BARRIDO BARRIDO: combina componentes de un microscopio de campo claro con un sistema de barrido para disecar ópticamente una muestra.

MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS DE TRANSMISION (MET) (MET): con poder de resolución de 0,1 a 0,2 nm. Permite observar la ultraestructura de cortes finos de las células. DE BARRIDO (MEB) O SCANNING SCANNING: con poder de resolución de 10 nm. Se observan superficies de células y de tejidos. DE FUERZA ATOMICA (MFA) (MFA): con resolución molecular y atómica. Es un microscopio no óptico. Es una sonda exploradora puntiaguda, en su extremo (púa) que contacta la muestra o puede subir y bajar, de acuerdo a las irregularidades de la superficie de la muestra biológica (la muestra puede estar en el agua).

MICROSCOPIO ÓPTICO MICROSCOPIO ÓPTICO O DE LUZ (COMPUESTO): denominado compuesto por estar constituido por dos sistemas de lentes. (OBJETIVO Y OCULAR). Agrandando las imágenes de pequeños objetos.

MICROSCOPÍA Y TÉCNICAS DE ENFOQUE – H1 Esquema que asigna cada componente del Microscopio Compuesto. - TUBO - REVÓLVER PORTAOBJETIVO - COLUMNA O BRAZO PARTE MECÁNICA O ESTATICO - PLATINA - PIE O BASE - TORNILLO MACROMETRICO - TORNILLO MICROMETRICO - OCULAR/ES - OBJETIVO/S PARTE ÓPTICA - APARATO DE ILUMINACIÓN

- ESPEJO - CONDENSADOR - DIAFRAGMA

FIG.1.1

TUBO: sostiene el sistema de lentes, Ocular/es en su parte superior y Objetivos en la inferior (acoplados al sistema revólver). Su longitud es de 160 mm; puede portar uno o más Oculares. Puede ser Vertical u Oblicuo, determinando el eje del microscopio. COLUMNA O BRAZO: es la parte que sostiene al Tubo y a la Platina; permite trasladar el microscopio. Se articula con el Tubo, permitiendo a éste, movimientos de ascenso y descenso (con la utilización de los tornillos de enfoque).

CÁTEDRA "B" DE CITOLOGÍA, HISTOLOGÍA Y EMBRIOLOGÍA – F.C.M. – U.N.L PLATINA: es una pieza metálica, de forma diversa (rectangular, circular o cuadrada). Dispuesta en forma perpendicular al eje óptico, sirve de apoyo al preparado, para su observación. Está provista de un orificio central, el cual permite el paso de los rayos de luz procedentes del aparato de iluminación, situado por debajo de ella. Puede ser fija, con pinzas que sujeten el preparado, el cual tendrá que ser desplazado manualmente para observar distintos campos; puede ser móvil. Algunos modelos más modernos tienen la posibilidad, a través de un sistema de tornillos, de imprimirle al objeto coloreado (preparado) desplazamientos anteroposteriores y de derecha a izquierda. PIE O BASE: base de sustentación del aparato, siendo diversa su forma. SISTEMA REVÓLVER: disco giratorio adosado al borde inferior del tubo, donde se atornillan los distintos objetivos. TORNILLO MACROMÉTRICO: como su nombre lo dice es el de mayor tamaño. Permite desplazamientos rápidos de aproximación (que se observan a simple vista) TORNILLO MICROMÉTRICO: permite realizar movimientos imperceptibles, posibilitando el enfoque de detalles finos (el enfoque definitivo del preparado); el desplazamiento del tubo no pasa de unos 3mm. Su mecanismo es muy delicado y no debe forzarse, razón por la cual conviene comenzar el trabajo colocándolo en la mitad de su recorrido Dichos tornillos se encuentran en la columna, a ambos lados del microscopio, permitiendo desplazamientos a expensas del tubo. En otros modelos más modernos,, los sistemas de enfoque rápido y lento se encuentran en un solo tornillo; y en ellos es la platina la que asciende y desciende. OCULAR/ES: cilindro hueco metálico, ubicado en el extremo superior del Tubo, con una lente o sistema de lentes convergentes, en cada extremo. La Lente Ocular es la más próxima al ojo del observador y la Lente Colectora o de Campo es la inferior (recibiendo directamente los rayos provenientes del objetivo). Aumenta sólo la imagen producida (en su plano focal) por el objetivo, pero sin agregar nuevos detalles y corrigiendo defectos de la imagen. OBJETIVO/S: por su aplicación pueden ser: A. A seco: constituidos por un sistema de lentes, una principal y cercana al objeto (preparado), que es la Lente Frontal, responsable del aumento del objetivo . Las otras son lentes simples, dispuestas en dobletes o tripletes, unidas entre sí por una sustancia transparente; corrigen los defectos (aberraciones). Al usar estas lentes, se interpone aire entre la lente frontal y el preparado. B. De inmersión: permiten los mayores aumentos y pueden ser para agua, glicerina o aceit aceite e; los más utilizados son los de inmersión en aceite (sintético o de cedro). Para evitar que una gran cantidad de rayos luminosos, que atraviesan el portaobjeto, se desvíen (difracción), al salir del mismo es que se coloca una gota de aceite de cedro sobre el preparado, ya que el aceite tiene un índice de refracción muy próximo al del vidrio. Aquí se interpone aceite, entre la lente frontal y el preparado. INDICE DE REFRACCION DE:    

VIDRIO: n = 1,52 AIRE: n = 1,00 AGUA: n = 1,33 ACEITE: n = 1,52

MICROSCOPÍA Y TÉCNICAS DE ENFOQUE – H1 LECTURA DE UN OBJETIVO OBJETIVO DE X 25 (planocromático) APERTURA NUMÉRICA = 0,45 º TUBO = 160 mm CUBREOBJETO DE 0,17 mm de espesor

OBJETIVO = Seno del semiángulo de abertura PORTA OBJETO

APERTURA NUMÉRICA (A.N.): la abertura numérica de un objetivo representa la cantidad máxima de rayos que la Lente Frontal puede captar; la misma viene grabada en los objetivos. A mayor abertura numérica del objetivo, mayor nitidez de la imagen. Responde a la siguiente fórmula: A.N. = n x senµ, lo cual significa que el índice de refracción (n), del medio que se encuentra entre el objeto o preparado y la lente frontal del objetivo, se multiplica por el seno (sen) de la mitad del ángulo del cono de la luz que entra en el objetivo. Dicho ángulo está determinado por los rayos lumínicos más periféricos. ESPEJO: por lo general se encuentra sostenido a la columna, con movimientos en todas direcciones; otros modelos de microscopio tienen el espejo en la base o pie. El espejo de cara plana se utiliza cuando la luz es excesiva y el espejo de cara cóncava se utiliza para captar la mayor cantidad de rayos luminosos, cuando la luz es débil. CONDENSADOR: concentra los rayos luminosos reflejados por el espejo y los proyecta sobre el preparado, con un ángulo de incidencia apropiado para que atraviesen la Lente Frontal del objetivo. En definitiva, es un conjunto de lentes que aumentan la intensidad luminosa, desviando los rayos de luz de una zona relativamente extensa hacia una reducida. El Condensador debe estar alto, es decir lo más cerca de la platina posible, por lo tanto lo más cercano al Objeto. En algunos microscopios se puede acercar o alejar el Condensador con los movimientos de un tornillo que se ubica a un lado de la Columna. DIAFRAGMA: generalmente acompaña a los Condensadores, pero puede ser independiente....