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Tipos de Siembra en medios de cultivo...

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UNIVERSIDAD PRIVADA DE TACNA FACULTAD DE INGENIERIA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL

CURSO: MICROBIOLOGÍA

TEMA: TIPOS DE SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO

DOCENTE: Blga. CLAUDIA CLAVIJO KOC

ALUMNA: ANGHEL ALEXANDRA QUENTA CHATA

TACNA-PERÚ 2020

Curso: Microbiología

RESUMEN

Los microorganismos naturalmente se encuentran mezclados entre sí. Para poder estudiarlos se deben cultivar en el medio que sea necesario para su crecimiento y desarrollo de las colonias emergentes, cada uno necesita nutrientes diferentes pero con los conocimientos adquiridos anteriormente se pudo comprender el uso correcto del medio a utilizar. No obstante se requiere un cultivo puro, por ende, se procede a los métodos de siembra, los cuales consisten en introducir una muestra inoculada en una placa de Petri o en un tubo, según las condiciones de cada microorganismo , es decir dependerá del tipo de microorganismo para establecer la temperatura de incubación y el tiempo que se realizará. Las técnicas de sembrado son para adquirir colonias puras para posteriormente estudiarlas de acuerdo al fin que se desee. Mediante el presente trabajo se explicará en qué consisten los métodos de siembra, las características de cada uno y en qué tipo de microorganismos se emplearan, así como también se explicará la preparación de una siembra.

Curso: Microbiología

ABSTRACT

The microorganisms are naturally mixed with each other. In order to study them, they must be cultivated in the medium that is necessary for their growth and development of the emerging colonies, each one needs different nutrients, but with the knowledge acquired previously, the correct use of the medium to be used could be understood. However, a pure culture is required, therefore, the seeding methods are carried out, which consist of introducing an inoculated sample in a Petri dish or in a tube, depending on the conditions of each microorganism, that is, it will depend on the type of microorganism to establish the incubation temperature and the time to be carried out. The seeding techniques are to acquire pure colonies to later study them according to the desired purpose. Through the present work, it will be explained what the sowing methods consist of, the characteristics of each one and what type of microorganisms will be used, as well as the preparation of a sowing.

Curso: Microbiología

INDICE 1.

CAPÌTULO I......................................................................................................................1 1.1.

Tema............................................................................................................................1

1.2.

Tipo de investigación..................................................................................................1

1.3.

Objetivos.....................................................................................................................1

1.4.1 Objetivo General.......................................................................................................1 1.4.2 Objetivos Específicos.................................................................................................1 2.

3.

CAPITULO II.....................................................................................................................2 2.1.

Marco Teórico.............................................................................................................2

2.2.

Tipos de siembra (placa)............................................................................................3

2.3.

Técnicas de siembra en placa.....................................................................................4

2.4.

Tipos de siembra (tubo).............................................................................................5

2.5.

Técnicas de siembra en tubo......................................................................................5

2.6.

Materiales....................................................................................................................7

2.7.

Metodología.................................................................................................................7

2.7.1.

Preparación del medio de cultivo......................................................................7

2.7.2.

Preparación del medio diluyente.......................................................................9

2.7.3.

Preparación del material de vidrio....................................................................9

2.7.4.

Preparación de la muestra (inóculo).................................................................9

2.7.5.

Siembra...............................................................................................................9

CAPITULO III.................................................................................................................12 3.1.

Conclusiones.............................................................................................................12

3.2.

Bibliografía...............................................................................................................12

Curso: Microbiología

1. CAPÌTULO I DATOS GENERALES DE LA MONOGRAFIA

1.1.

Tema

TIPOS DE SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO

1.2.

Tipo de investigación

Descriptiva

1.3.

Objetivos 1.4.1 Objetivo General 

Identificar el tipo de siembra de los microorganismos

1.4.2 Objetivos Específicos 

Conocer los diferentes tipos de siembra para el estudio correcto de los microorganismos.



Conocer los principios y fundamentos de los tipos de siembra en medios de cultivo.



Conocer de forma más detallada el procedimiento utilizado en la siembra para los microorganismos.

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2. CAPITULO II 2.1. 

Marco Teórico

Según (Tortora, Funke & Case), la mayor parte de los trabajos bacteriológicos requieren de cultivos puros, o clones, de bacterias. El método de aislamiento empleado con más frecuencia para obtener cultivos puros es el método de siembra por estría en placa.



La forma más eficaz y rápida para obtener cultivos puros de los microorganismos, los cuales forman colonias discretas, se lleva a cabo empleando un método de siembra en placa. Este método implica el distanciamiento y la fijación de los microorganismos particulares, cada uno de éstos se multiplica y forma colonias.



La siembra o también llamada inoculación consiste en introducir de forma artificial una porción de muestra (inoculada) en un medio adecuado, con el propósito de iniciar un cultivo microbiano, para su crecimiento y multiplicación. Una vez realizado el sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura propia para su desarrollo.



Algunas reglas indispensables para la siembra son: -

Que se realicen de manera esterilizada, es decir tanto el instrumental como la persona que manejara los medios y la siembra deben contar con los implementos de protección.

-

Que no haya un exceso de manipulación en cuanto al medio de cultivo a usar.



-

Que se trabaje lejos de una corriente de aire.

-

Que se utilice un mechero o un flujo laminar. Existen diversos tipos de siembra, los cuales se eligen de acuerdo al medio empleado y los requerimientos del microorganismo que se desea estudiar.

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2.2.

Tipos de siembra (placa)

a) Siembra por inmersión: Se ubica el inóculo en una placa Petri y en él se vierte el medio de cultivo, no sin antes haberlo pasado por un proceso de fundición. Este método en particular se emplea para microorganismos aerobios. b) Siembra en doble capa: Se actúa del mismo modo que la inmersión. Cuando el medio haya solidificado se vierte una cantidad extra de medio imprescindible para tapar la capa anterior (usualmente 10 ml aproximadamente). Este método es empleado para microorganismos microaerofílicos y anaerobios facultativos. c) Siembra en superficie: Se echa sobre una placa de Petri el medio de cultivo previamente fundido, se espera a que solidifique para posteriormente colocar el inóculo sobre la superficie. Se requiere apoyo de la espátula de Drigalsky y se esparce el inóculo hasta su absorción completa por el medio de cultivo. Esta técnica se emplea para microorganismos aerobios estrictos. d) Siembra en estría: Se funde el cultivo previamente y se vierte sobre una placa de Petri para esperar a que solidifique. e) Siembra volumétrica: Esta técnica de siembra radica en sembrar una muestra líquida, en la cual su volumen no puede ser desconocido, en medios de cultivo tanto líquido como sólido. f) Siembra masiva: Se emplea cuando se quiere realizar una siembra abundante y se puede utilizar la espátula de Drigalsky. En esta ocasión la gota de la muestra líquida se extiende 3

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con la espátula mencionada por toda la superficie del medio de cultivo sólido generando movimientos espiralados. Esta técnica también se puede hacer con un hisopo grueso inmerso de un cultivo líquido seguidamente del esparcimiento sobre todo el espacio de la placa Petri con agar.

2.3.



Técnicas de siembra en placa

Técnica de siembra por estría en placa: Es el método más sencillo y el más empleado para la obtención de cultivos axénicos, el cual está formado por una única especie o cepa. Para este procedimiento se emplea un asa de siembra y se coge una muestra de la población mixta y luego se procede a hacer estrías sobre la superficie de un medio sólido listo en una placa Petri. Según se va realizando las estrías en forma de zigzag con la ayuda del asa se van colocando en la superficie del medio menos microorganismos. Luego se flamea el asa y se palpa en la zona donde se realizaron las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica en la parcela de medio donde no se había sembrado. Rehaciendo el proceso anterior más veces se logrará la separación de células. Seguidamente las placas de Petri se colocan para incubar en un lugar idóneo, para propiciar que las células que se aislaron experimenten ciertas divisiones para conformar posteriormente colonias (Figura 1).

Figura 1. Siembra por estría en placa

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Técnica de extensión en placa:



Las muestras disueltas se siembran de forma directa en la placa de agar, proliferándolo con ayuda del asa de Drigalsky de cristal estéril. La suspensión se absorbe en el agar, por lo cual se dejará las células de los microorganismos sobre la superficie. En las dos técnicas las placas de Petri se incuban hasta que aparezcan colonias.

2.4.

Tipos de siembra (tubo)

a. Siembra por dilución: Se coge el tubo de ensayo con medio líquido, como por ejemplo el caldo simple. Se agarra el material que se diluirá y se siembra en el tubo empleando el asa contenida de microorganismos, se realiza movimientos. b. Siembra por estrías en superficie: Se siembra el cultivo en la superficie del agar inclinado, mediante un tubo de ensayo, seguidamente se recubre toda la superficie con el asa bacteriológica, esterilizada y contenida con el material que se sembrará, realizando estrías angostas. Se comienza por el lado más profundo de la superficie inclinada y se concluye la estría en la parte más cercana a la parte inicial del tubo. c. Siembra por punción: Se utiliza la aguja de platino y un medio de cultivo sólido usualmente se emplea el tubo de ensayo. Lo diferente de este método es que la aguja (con el inóculo) debe pasar de forma perpendicular en el medio de cultivo.

2.5.

Técnicas de siembra en tubo A. Siembra por inoculación

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Con el asa bacteriológica, previamente esterilizada se coge una porción del inóculo para introducirlo en el centro del medio líquido, agitándolo, sin tocar las paredes del tubo (Figura 2).

Figura 2. Siembra por inoculación

B. Siembra por estría, en tubos de agar inclinado: Tomar una muestra con el asa bacteriológica y hacer zigzag empezando por la superficie más profunda (Figura 3). Figura 3. Siembra por estría en tubos de agar inclinado

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2.6.

Materiales



Pipetas de 1 ml y 10 ml



Matraz Erlenmeyer de 250 ml



Espátula



Agar plate count



Agar VRBL



Agar Baird-Parker



Caldo Mc Conkey



Espátulas de Drigalsky



Placas de Petri



Estufa de cultivo



Baño termostático



Recipientes para realizar Baño maría



Asa de platino



Agua destilada



Muestras para analizar



Tubos de ensayo de 10 ml y 20 ml



Campanas de Durham



Gasa y algodón



Agua de peptona

2.7.

Metodología

2.7.1. Preparación del medio de cultivo Se prepara el medio conforme lo indica su rótulo. Seguidamente se transfiere dicho medio al matraz Erlenmeyer y se adiciona la cantidad de agua destilada. Se trata de disolver los grumos que se forman y se lleva a baño maría, hasta que el medio de 7

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cultivo se vuelva transparente, se tapa el matraz con una torunda de algodón envuelto en gasa. Dicha torunda de estar revestida con material impermeable y esterilizado en la autoclave a 121ºC unos 15 minutos. Si se emplea de forma inmediata, dejarlo enfriar a una temperatura promedio de 45ºC. Si en caso el medio se solidifica, se funde otra vez a baño maría antes de

usarlo.

En cuanto al caldo de Mc Conkey, de igual manera se inicia el proceso de cultivo de acuerdo a lo que se indica en su rótulo, y se reparte el caldo colocando 10 ml en tubos de ensayo de 20 y 10 ml en tubos de 50. Se emplea en los tubos el uso de una campana de Durham invertida. Se cubren los tubos y se llevan a esterilizar en la autoclave a 121ºC durante unos 15 minutos.

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2.7.2. Preparación del medio diluyente Se realiza la preparación de un volumen de agua peptonada, siguiendo el rótulo y se reparte en porciones de 9 ml en tubos de ensayo. De la misma manera se preparan matraces conteniendo 90 ml de agua peptonada. 2.7.3. Preparación del material de vidrio Se envuelven cada una de las placas de Petri y las pipetas con papel tipo manteca. Los tubos de ensayo se tapan con torundas de algodón o también se puede utilizar tapas de metal y se esterilizan en estufa de calor seco a 150ºC por una hora y media. 2.7.4. Preparación de la muestra (inóculo) Se realiza este procedimiento acorde a lo que caracteriza a la muestra, es decir si su contaminación es elevada, media o baja. Se realizan las diluciones de la siguiente manera: -

Se pesan 10 gramos si es que es una muestra sólida o en todo caso se mide 10 ml si es que es una muestra líquida, de manera que se encuentren en forma aséptica, se realiza el procedimiento cerca de un mechero y se transfiere a un matraz conteniendo 90 ml de agua peptonada. Obteniéndose de esta manera una dilución 10 1:100 (¿¿−2) y de este modo en forma sucesiva. ¿ 2.7.5. Siembra



Agar plate count, se emplea para el recuento total y se procede de la siguiente manera: Se precede a la medición de 1 ml con la pipeta estéril de la dilución que se va a sembrar, se echa sobre una placa, evitando levantar la tapa de manera exagerada. Se agregará de 10 – 12 ml de medio APC previamente fundido y a la temperatura no mayor a 45 grados. Tapar de manera inmediata y realizar movimientos en sentido anti horario, horario, de izquierda a derecha, adelante, atrás y en diagonales (unas 5 veces en cada sentido). Se dejará solidificar, luego se invertirá la placa de forma que la tapa quede en la base y se la llevará a la estufa de cultivo a 30ºC. El tiempo de incubación es de 72 horas aproximadamente. Una vez cumplido este tiempo se procederá a la lectura. 9

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Cada una de las células aisladas proporcionará una colonia, de manera que el número de estás ayudara a estimar el número de células presentes en la muestra original que se sembró. Para que el recuento sea válido es indispensable contar unas 30 a 300 colonias con el objetivo de disminuir el error de la medida. 

Agar VRBL (Violeta rojo bilis lactosa) se emplea para el recuento de coliformes. Se solidifica el medio y se vierte una capa de 8-10 ml de medio de cultivo, se solidificará, se invertirá la placa y se incubará en una estufa de cultivo a 37ºC por 48 horas aproximadamente. Los coliformes son bacterias que fermentan la lactosa, y acidifican el medio, produciendo de esta manera el viraje del indicador de pH, el cual está contenido en el medio, de tal forma que se verá el color rojo intenso de éste. A razón de ello, se visualizaran colonias de color rojo púrpura, de 1 mm a 2 mm de diámetro, rodeadas, usualmente de una zona rojiza de bilis precipitada.



Agar Baird – Parker, empleado para el recuento de staphylococcus coagulasa positiva, y en esta técnica se verterá primera en la placa 10 ml – 12 ml del medio de cultivo fundido. Luego cuando el medio solidifique y este firme, se inoculará con la intervención de la espátula de Drigalsky hasta que se absorba totalmente. Se cierra la placa para invertirla e incubarla unas 48 horas a 35ºC. La presencia de Staphylococcus aureus se visualiza por la presencia de colonias de color negro y borde incoloro, convexas, rodeadas de color opaco y una parte clara extrema.



Caldo Mc Conkey , utilizado para coliformes, se usa de la manera en que la cada dilución se siembra en 9 tubos de caldo Mc Conkey de la siguiente manera: Todos estos tubos se incubaran en una estufa para cultivo durante 48 horas aprox. y 10 ml de dilución en 10 ml de caldo preparado con el doble de la 3 tubos concentración establecida según el rótulo. 1 ml de dilución en 10 ml del caldo de la misma manera que el aanterior, 3 tubos siguiendo los datos del rótulo.

3 tubos

0.1 ml de dilución del caldo con la concentración que sale en el rótulo.

a 37ºC. Una vez que hayan pasado las horas establecidas, se apuntará los números de tubos positivos, los cuales son los tubos que tienden de un color azul a amarillo y se muestra la presencia de gas.

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Tabla de NMP y límites de confianza (95%)

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3. CAPITULO III 3.1.

Conclusiones Se logró identificar los tipos de siembra, en este caso los que son por placas de



Petri y los que se realizan en tubos. Se identificaron los tipos de siembra acorde al estudio, por ejemplo el Agar



VRBL (Violeta rojo bilis lactosa) se emplea para el recuento de coliformes....