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TP4 : Détermination des protéines

Dosage de l'albumine de sérum bovin en utilisant la spectrophotométrie UV-Vis et la loi de Beer-Lambert....

Description

Laboratoire CHM 1979

TP4 – DÉTERMINATION DES PROTÉINES

Nom, prénom : Perrault-Lévesque, David Nom du coéquipier : Achille, Allahnah

Date de l’expérience : 20/10/16 Date d’échéance du rapport : 20/10/16

Groupe et jour : B, jeudi Numéro de la hotte : H25 Nom du démonstrateur : Stéphanie Gallant ! ! # de l’inconnu : 64 Concentration moyenne de l’échantillon : 0,173 ± 0,06 mg/mL Intervalle de confiance : 0,17 ± 0,01 mg/mL

! 1. INTRODUCTION

L’objectif de ce laboratoire vise, entre autres, à introduire la spectrophotométrie UV-Vis et son utilité en chimie analytique. Outre cela, il sera question d’effectuer le dosage de la concentration de l’albumine de sérum bovin (BSA) en solution par étalonnage, ainsi qu’analyser les facteurs influençant ce paramètre. (1) Les principes de ce laboratoire reposent d’abord sur la spectrophotométrie, une technique par laquelle on expose une solution à une certaine longueur d’onde passant à travers de celle-ci. (1) Chaque solution a des propriétés optiques différentes et l’absorbance du rayonnement devient maximale à une certaine longueur d’onde d’exposition. (1) Ce paramètre est lié de façon proportionnelle à la concentration, comme le montre la loi de Beer-Lambert (1) :

𝐴 = # 𝜀% 𝑏𝐶 Cette équation montre que l’absorbance (A) est le produit de l’absorptivité molaire ou massique du composé (𝜀% ,

)*# +)#),

), du trajet optique du rayonnement (𝑏, 𝑐𝑚) et

la concentration massique du composé absorbant (𝐶, 𝑚𝑔/𝑚𝐿 ). En doublant la concentration de la substance analysée, on double ainsi l’absorbance du composé. (1) Outre la concentration, une mesure d’absorbance est également influencée par le pH, la température de l’échantillon et le temps si l’analyte a été soumis à la méthode de Lowry, expliquée plus loin. (1) Pour qu’une substance absorbe les fréquences des rayonnements UV-Vis, celleci doit contenir des électrons pi : les électrons sigma sont trop bas en énergie pour être sensibles à ces fréquences. Les portions d’une molécule contenant des électrons pi sont donc appelées des chromophores et sont responsables de l’absorption des rayons UV-Vis. (2) Dans la présente expérience, on souhaite mesurer une absorption d’une longueur d’onde du spectre visible : or, le

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! chromophore présent dans l’albumine de sérum bovin (CO-NH), soit le lien peptidique entre les acides aminés, absorbe dans l’ultraviolet. (2) On peut solutionner cette problématique en utilisant la méthode de Lowry, qui permettra de mesurer une absorbance du BSA dans le spectre visible. (2) Cette technique consiste à former un dérivé coloré de la protéine, en ajoutant d’abord des ions cuivre en milieu basique aux liens peptidiques. Il y aura ensuite une réaction d’oxydoréduction entre les ions cuivre et les acides aminés oxydables comme la tyrosine et le tryptophane. (2) Sous sa forme réduite, le cuivre pourra oxyder le réactif de Folin-Ciocalteu (complexe d’acides phosphomolybdiques et phosphotungstiques), qui virera la solution au bleu-violet. (2) Avec un complexe protéique d’une telle couleur, l’absorbance maximale sera donc mesurée dans les longueurs d’onde du vert, à exactement 540 nm. (2)

Cu2++ BSA

[BSA-Cu 2+]

Cu2++ (Acides aminés oxydables)

Cu+ + (Acides aminés oxydés)

[BSA-Cu+] + Réactif de Folin-Ciocalteu oxydé

[BSA-Cu 2+] + Réactif de Folin-Ciocalteuréduit

En traçant une droite de régression linéaire, on peut déterminer l’absorptivité massique du BSA à 540 nm par la loi de Beer-Lambert et la concentration du BSA dans le mélange de solution cuivrée alcaline et de réactif de Folin : 𝑚𝑔 [𝑖𝑛𝑖𝑡𝑖𝑎𝑙𝑒]# 𝑚𝑔 𝑚𝐿 𝑋#𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒#𝑖𝑛𝑖𝑡𝑖𝑎𝑙(𝑚𝐿) [𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙𝑒]#( ) = # 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒#𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 #𝑑𝑒#𝑙𝑎#𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛#(𝑚𝐿) 𝑚𝐿 𝑦 = 𝑎𝑥 𝐴 = 𝑎𝐶, 𝑜ù#𝑎 = 𝜀% 𝑏 𝜀% =

𝑎 𝑚𝐿#𝑚𝑔FG 1,16#𝑐𝑚

On peut enfin déterminer la concentration initiale d’une solution inconnue de BSA en connaissant différentes mesures d’absorption de celle-ci. (2)

2

! 𝐴 𝐵𝑆𝐴 #𝑒𝑛#𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛, 𝑑𝑖𝑙𝑢é𝑒 = # # 𝑎 𝐵𝑆𝐴 #𝑒𝑛#𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛, 𝑑𝑖𝑙𝑢é𝑒#𝑋#𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒#𝑑𝑒#𝑙𝑎#𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 𝐵𝑆𝐴 𝑖𝑛𝑐𝑜𝑛𝑛𝑢𝑒 = # 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒#𝑖𝑛𝑖𝑡𝑖𝑎𝑙 #𝑑𝑒#𝐵𝑆𝐴 2. PARTIE EXPÉRIMENTALE Les procédures expérimentales détaillées liées à cette expérience se trouvent dans l’étendue de pages indiquée en référence dans le cahier de laboratoire. (1) On trouve également un schéma du spectrophotomètre utilisé à la page 35. (1) L’appareil utilisé émet dans la gamme de longueurs d’ondes du visible et est le modèle suivant : Spectronic*𝟐𝟎𝑻𝑴 .!Les mesures d’absorbance ont été effectuées à une précision de ± 0,05. La solution alcaline de sulfate de cuivre, quant à elle, a été préparée dans un cylindre gradué de 100,0 ± 0,5 mL. Une pipette jaugée de classe A de 5 ± 0,06 mL a été utilisée afin de transférer les volumes de sulfate de suivre dans les différentes éprouvettes. Enfin, des micropipettes à volume réglable de 200-1000 microlitres ont été employées afin de manipuler les volumes de BSA, d’eau et de réactif de Folin. Ces mesures possédaient une marge de tolérance de ± 0,003 mL. (1) Enfin, bien que le temps a été mesuré au dixième de seconde près, les mesures d’absorbance étaient effectuées à ± 1 min. Aucune modification n’a été apportée au protocole initial.

3

!

3. RÉSULTATS ET DISCUSSION Tableau 1 : Mesures d’absorbance de solutions alcalines cuivrées de BSA 40 minutes suite à l’ajout du réactif de Folin-Ciocalteu Éprouvette

Volume de 1

BSA

Volume de

Volume de

Volume

Concentration

solution

réactif de

d’eau

de BSA dans

alcaline de

Folin-

distillée

l’échantillon

sulfate de

Ciocalteu

± 0,0001mg/mL

suivre

± 0,003 mL 1 (blanc)

Absorbance

2

± 0,006 mL

± 0,003 mL

± 0,003 mL

5,000

0,500

1,000

± 0,05 0,00

2

0,100

5,000

0,500

0,900

0,0046

0,02

3

0,200

5,000

0,500

0,800

0,0092

0,06

4

0,400

5,000

0,500

0,600

0,0185

0,16

5

0,500

5,000

0,500

0,500

0,0231

0,25

6

0,600

5,000

0,500

0,400

0,0277

0,17

7

0,800

5,000

0,500

0,200

0,0369

0,38

8

0,400

5,000

0,500

0,600

0,11

9

0,500

5,000

0,500

0,500

0,13

10

0,600

5,000

0,500

0,400

0,16

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 1 !Les!éprouvettes!2!à!7!sont!préparées!avec!du!BSA!0,3002!mg/mL!dans!un!volume!de! 6,5!mL!.!Les!solutions!8!à!10!sont!préparées!avec!du!BSA!de!concentration!inconnue.! 2 !!La!solution!elle-même!était!composée!de!98,0!±!0,5!mL!de!carbonate!de!sodium,!1,0!±! 0,5!mL!de!tartrate!de!sodium!et!1,0!±!0,5mL!de!sulfate!de!suivre.! 4

! Tableau 2 : Mesures d’absorbance de la solution contenue dans l’éprouvette 4 selon le temps suite à l’ajout du réactif de Folin-Ciocalteu Temps

Absorbance

± 1 min

± 0,05

0

0,110

5

0,120

10

0,195

15

0,210

20

0,221

25

0,230

30

0,240

35

0,250

40

0,250

45

0,250

Tableau 3 : Mesures de pH et d’absorbance de trois solutions alcalines cuivrées de BSA Éprouvette

pH mesuré

pH mesuré

Absorbance

Absorbance

par le papier

par le papier

avant l’ajout de

après

pH

pH après

HCl 3M

l’ajout de

ajout de HCl 3M

± 1 pH

± 1 pH 4

10

6

10

7

10

HCl 3 M

1

± 0,05

± 0,05

0,16

0,11

5

Absorbance

!

0,3

0,25

0,2

0,15

0,1

0,05

0 0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Temps!(min)

Figure 1 : Mesures d’absorbance de l’éprouvette #5 en fonction du temps

Absorbance

0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

Concentration!du!BSA!en!solution!(mg/mL)

Figure 2 : Absorbance des solutions alcalines cuivrées de BSA #2 à #7 en fonction de leur concentration et 40 minutes suite à l’ajout du Folin ( y = 10,288x – 0,0324 ; R² = 0,88335 )

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! Tableau 4 : Analyse des données relevées par la courbe d’étalonnage de la figure 2

Pente du

Absorptivité

Coefficient de

graphique

massique

corrélation

calculée ∈%#)RS

𝑅U

𝑚𝐿#/#𝑚𝑔

𝑚𝐿#𝑚𝑔FG 𝑐𝑚FG

10,288

8,87

0,93995

Tableau 5 : Concentrations massiques du BSA de composition inconnue dans leurs échantillons et dans la solution initiale Éprouvette

Concentration massique du

Concentration

Concentration

massique initiale massique initiale

BSA dans

du BSA

l’éprouvette

Écarttype

moyenne du

Intervalle de confiance

BSA

(P

=

95%) ± 0,005 mg/mL

± 0,08 mg/mL

8

0,011

0,18

9

0,013

0,17

10

0,016

0,17

mg/mL

mg/mL

mg/mL

0,173

0,006

0,17 ± 0,01

L’analyse des résultats se fait en trois temps : l’analyse de la fiabilité de la courbe d’étalonnage, l’examination de la méthode visant à déterminer la concentration initiale d’une solution de BSA et l’effet du pH sur l’absorbance. Dans ces trois cas, des mesures d’absorbance ont été effectuées par spectrophotométrie à 540 nm

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! dans le but d’examiner la dépendance de cette variable face à la concentration d’une substance en solution présentant une coloration. En effet, comme ces deux variables sont liées de façon directement proportionnelle par la loi de BeerLambert, il est facile d’identifier des inconnus via une régression linéaire ou d’examiner l’effet de divers facteurs sur ces une de ces variables. La courbe d’étalonnage présentée à la figure 1 avait pour but d’idéaliser la loi de Beer-Lambert de façon la plus fidèle possible. Celle-ci devait en effet servir à déterminer la concentration inconnue d’échantillons à partir de leurs mesures d’absorbance et de l’absorptivité massique révélée par la pente du graphique. Cependant, avant d’étalonner

divers

échantillons

de

BSA

à

diverses

concentrations, un paramètre particulier devait être pris en compte : la protéine de sérum bovin seule n’absorbe pas les rayonnements du visible (elle est incolore) et devait donc réagir avec des ions cuivre et un certain réactif (Folin-Ciocalteu) afin de créer une solution colorée pouvant absorber dans le visible. Cela correspond à la gamme de longueurs d’ondes émises par le spectrophotomètre utilisé en laboratoire. Ainsi, cette réaction prenait un certain temps à se dérouler et la réaction se devait d’être complétée avant de procéder à des mesures d’absorbance. C’est pourquoi l’absorbance d’une solution à plusieurs temps différents, tel que démontré dans la figure 1, se stabilisait à environ 40 minutes. Cette figure, à vue d’œil, révèle une tendance logarithmique par la disposition du nuage de points : la variation instantanée de l’absorbance à un temps précis est très intense au début et est presque négligeable vers des temps plus élevés. Les mesures spectrophotométriques, afin de générer une stabilité, devaient donc s’amorcer un certain temps après la mise en contact du réactif avec la BSA afin de former un complexe cuivré. C’est pourquoi il y avait un temps d’attente entre l’amorce de prise des mesures et la préparation des solutions. C’est aussi pourquoi la courbe d’étalonnage a été construite à partir de mesures d’absorbance prises 40 minutes suite à l’amorce de la réaction. Cette même courbe, construite à partir de six couples de données, se révèle toutefois moyennement fiable à la loi de Beer-Lambert. Premièrement, le coefficient de corrélation révélé par la

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! tendance linéaire s’élève à environ 0,94 : la corrélation linéaire parfaite de 1 n’est donc pas atteinte et les couples de données présentent donc un défaut de proportionnalité non négligeable. Ensuite, la loi de Beer-Lambert est directement proportionnelle : ce n’est pas le cas de la droite de régression, puisqu’elle possède une valeur d’ordonnée à l’origine, négligée dans les calculs. Autrement dit, chaque donnée d’absorbance sur la courbe est bonifiée d’un facteur « b », soit l’ordonnée à l’origine : celui-ci est complètement négligé dans le calcul pour substituer l’équation de la droite dans l’équation de Beer-Lambert. La fiabilité de la courbe d’étalonnage est donc affectée négativement par la présence d’une ordonnée à l’origine. Ensuite, on remarque la présence d’un point aberrant sur le graphique (figure 2), qui a su certainement influencer la pente de la régression en raison du faible nombre de données présent dans l’échantillonnage (5). En jetant un coup d’œil aux barres d’erreurs transversales symbolisant l’incertitude de mesure sur l’absorbance, cela confirme que ce point dévie fortement de la régression. La méthode du spectrophotomètre peut donc se révéler sensible aux erreurs de manipulations : la limite de détection, où on perçoit une absorbance non nulle dans l’échantillon, dépend du blanc qui doit être calibré à chacune des lectures sur l’appareil. La transmission mesurée à travers le blanc se doit donc de demeurer à 100% avant chaque lecture afin de définir un point de référence pour les lectures. Une inattention de l’expérimentateur concernant la calibration de l’appareil peut donc fausser complètement l’absorbance d’une solution en fonction de sa concentration, ce qui provoque des données déviant fortement de la régression. La courbe de tendance présente donc des lacunes à se comparer à une relation directement proportionnelle. À l’aide de l’absorptivité massique calculée à partir de la courbe d’étalonnage discutée précédemment, il était ainsi possible d’identifier une solution de BSA dont on ne connaissait pas la concentration initiale. La fiabilité de la courbe d’étalonnage ayant été discutée, on peut maintenant analyser de façon plus concrète les résultats obtenus quant à l’identification de cette solution de BSA à concentration inconnue. Par l’absence d’une valeur de référence, on ne peut

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! formuler une analyse basée sur l’exactitude, mais on peut cependant évaluer la précision de la méthode. On remarque d’abord que les concentrations massiques du BSA en solution présentent une incertitude absolue très élevée dans le tableau 5 : ± 0,08 mg/mL. Ces données sont donc très rapprochées de leur marge d’erreur et présentent, conséquemment, une incertitude relative élevée. Cela est dû aux nombreuses transformations algébriques accumulant plusieurs incertitudes de lecture : les préparations nécessitaient plusieurs pipetages de volumes, qui attribuent leur marge d’erreur à l’incertitude de l’instrument. La précision de la méthode est donc limitée par ce facteur. Cependant, la concentration massique initiale moyenne de l’inconnu néglige ce facteur en tenant plutôt compte de l’écarttype : celui-ci est très mince en raison des valeurs très rapprochées des concentrations massiques mesurées dans les éprouvettes 8,9 et 10. L’intervalle de confiance se montre également très satisfaisant, puisqu’il prouve que la méthode a permis de générer des résultats très stables. On pourrait donc répéter un très grand nombre d’essais fiables sur le même inconnu à analyser : dans ce cas-ci, dans 95% des cas, les concentrations calculées seraient dans le mince intervalle de 0,17 ± 0,01 mg/mL. Au final, la technique ayant servi à analyser l’inconnu s’est montrée comme étant précise. Un autre point pouvant être questionné dans cette expérience est le fait d’analyser une autre protéine que la BSA dans les mêmes conditions, en la faisant réagir de la même façon avec le réactif de Folin-Ciocalteu en milieu alcalin. Tel que mentionné dans l’introduction, cette réaction formant le complexe cuivré est une suite d’oxydoréductions nécessitant la présence de groupes oxydables. L’affinité de la protéine avec le réactif de Folin-Ciocalteu et la capacité à créer un complexe coloré dépendra donc de l’abondance et du type d’acides aminés composant la protéine. Dans le cas de la BSA, celle-ci est riche en acides aminés oxydables comme la cystéine ou la tyrosine. (1) La BSA est également riche en acides aminés chargés, qui auront donc une affinité avec le cuivre voulant s’oxyder en milieu aqueux. (3) Une protéine riche en acides aminés apolaires ne pouvant pas être oxydés par les ions cuivre mettra davantage de temps à réagir avec le réactif

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! de Folin ou créera un complexe coloré moins contrasté. La variation d’absorbance en fonction de la concentration sera donc plus difficilement observable et les valeurs globales d’absorbance de la protéine seront également plus faibles. Enfin, un dernier point abordé lors de cette expérience concerne l’effet du pH sur les mesures d’absorbance. Selon le tableau 3, l’absorbance de l’échantillon a diminué lorsque du HCl a été ajouté dans la solution contenant la protéine. L’absorbance diminue en raison du même point ayant été abordé au dernier paragraphe : le réactif de Folin-Ciocalteu développe une affinité moindre avec la protéine qui altérera le complexe protéique responsable de la coloration. Une baisse du pH peut être à l’origine d’une dénaturation de la protéine, soit un changement plus ou moins réversible de sa conformation. (4)

Par simple

expérimentation avec le papier pH, celui-ci a révélé que le pH de la solution contenant la protéine est passé de 10 à 1. Une forte augmentation de l’acidité a donc provoqué une dénaturation considérable qui a alterné l’absorbance de la BSA : l’altération de la conformation de la protéine réduit fortement la stabilité du complexe engendrant la coloration. La BSA, au final, aura moins l’opportunité d’absorber dans le spectre visible en étant liée au complexe cuivré. 4. CONCLUSION En conclusion, l’objectif principal du laboratoire a bel et bien été atteint, soit le fait d’identifier un inconnu à l’aide d’une courbe d’étalonnage : celle-ci a tout de même conduit à des résultats précis, malgré des lacunes facilement repérables au niveau de la fiabilité de la courbe de tendance. Celle-ci visait à refléter la relation proportionnelle

de

Beer-...