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Two Hybrid Sistem metodologie biochimiche...

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TWO HYBRID SYSTEM Il saggio del doppio ibrido è un metodo semplice e rapido che consente di indentificare l’interazione tra due proteine. È ottimo per studiare i complessi binari. Per fare un esempio di interazione tra due proteine: immaginiamo di avere delle cellule. Una parte le trattiamo con un composto x, una parte con un composto y e ad una parte non aggiungiamo nessun composto (questo sar& il nostro controllo). Ci) che vogliamo sapere è come varia, all’aggiunta dei vari composti, l’interazione tra la proteina p53 e la MDM2 (e, ovviamente, se interagiscono). Questo viene studiato con il saggio del doppio ibrido. Il saggio del doppio ibrido inventato da Fields e Song nel 1989 è utilizzato per l’identificazione di interazioni pt-pt e si basa sulla modularità del fattore di trascrizione Gal4. Il fattore Gal4 di lievito pu) essere diviso in due componenti: un dominio di legame al DNA e un dominio di attivazione della trascrizione. Il fattore Gal4 nel lievito consente la trascrizione solo se si unisce a specifiche sequenze a monte del promotore. Il principio di funzionamento si basa nel creare due vettori: il primo detto “esca” che codifica la proteina X fusa con il dominio di legame del DNA e il secondo detto “preda” che codifica la proteina Y fusa con il dominio di attivazione della trascrizione. Se la proteina preda interagisce con l’esca, il gene reporter viene espresso. Questo saggio è fatto valutando l’espressione genica di un gene reporter, la cui espressione consente di verificare se date le due proteine queste sono interattori o meno. Questo grazie al fatto che l’interazione tra le due permette l’espressione del gene reporter. Non è necessario che le due proteine in questione siano fattori di trascrizione, nonostante la verifica dell’interazione si faccia mediante l’espressione del gene reporter. Questo è possibile invece grazie alla creazione di proteine chimeriche. Per produrre le proteine chimeriche utilizziamo la tecnologia ricombinante. Per la proteina esca facciamo un plasmide ricombinante che possiede il dominio di unione al DNA di Gal4 seguito dal frammento codificante la proteina esca. In questo plasmide non mettiamo il dominio di trans-attivazione. Facciamo un altro plasmide ricombinante con il dominio di transattivazione in frame con la proteina preda. Se le due proteine normalmente sono interattori, una volta prodotte dalla cellula (che usa l’informazione presente nei due plasmidi ricombinanti) andranno a legarsi, formando un sistema trascrizionalmente attivo: infatti presenter&, grazie all’unione delle due proteine, un dominio di attivazione della trascrizione e un dominio di legame al DNA. Questo complesso di trascrizione andr& a unirsi alla sequenza UAS presente in un ulteriore plasmide dentro la cellula (contando in fine per lo studio di due proteine, tre plasmidi ricombinanti da inserire in una cellula), regolando la trascrizione di un gene reporter (che pu) essere il gene lacZ’ per la beta-galattosidasi, il gene per la GFP, o un gene per resistenza antibiotica). In summa, il gene reporter si esprimerà solo se le due proteine esca e preda interagiscono, dando luogo a un sistema di controllo positivo. Possiamo anche creare dei sistemi di controllo negativo, in cui inseriamo i due plasmidi ricombinanti codificanti per le proteine esca e preda, ma non il gene reporter.

Naturalmente, in questo sistema non si dovr& esprimere il gene reporter, nonostante abbiamo le due proteine interattrici. La sola presenza del dominio di legame del DNA fuso ad una proteina X (esca) non d& trascrizione del reporter, ma anche nel caso di sola presenza del dominio di attivazione della trascrizione fuso alla proteina Y (preda) non si ha espressione del gene reporter. Quindi, solo se si crea una cotransfezione con tutti e tre i vettori e le proteine esca e preda sono interattori, si avrà espressione del reporter, per sistema di trascrizione attivo. Alcuni gene reporter sono, per esempio: - il gene Escherichia coli lacZ, la cui attivazione viene rilevata perché, quando coltivato in un terreno contenente il substrato X-Gal (5- bromo-4-cloroindol-3-il β-D-galattopiranoside), le cellule che esprimono il gene diventano blu, mentre quelle che non lo esprimono diventano bianche. Tecnica nota come “white/blu screening”. -

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Possiamo fare esprimere come reporter la GFP (“Green Fluorescent Protein”). Se c’è fluorescenza le proteine interagiscono, mentre se non formano un complesso di interazione non vedr) fluorescenza. Un altro gene reporter pu) essere il gene per l’istidina: il ceppo di lievito utilizzato per il doppio ibrido è AH109. Altra opzione è di usare come gene reporter un gene di resistenza ad un antibiotico. Se le pt interagiscono, anche in presenza di antibiotico, le cellule sopravvivono.

Abbiamo detto che si pu) usare anche la tecnica per studiare complessi ternari. Ci) si pu) fare inserendo un ulteriore plasmide ricombinante (in totale ne avremo 4 per cellula), con il gene codificante per la terza proteina. Se le tre proteine interagissero avremmo espressione del gene reporter. Se al gene esca sta attaccata la porzione di DBD e al gene preda quella di AD, al gene codificante la proteina non sta legato nessun altro gene. La terza proteina deve avere residui che interagiscono con le altre due. L’interazione avverr& direttamente fra le proteine che si presume interagiscano. Prima di fare un’analisi di questo tipo si fanno degli esperimenti a monte, che ci suggeriscano che le tre proteine formano un complesso e, possibilmente, tra quali porzioni proteiche questo avviene. Ad esempio, si possono creare dei mutanti per i putativi siti di interazione proteica (dopo avere effettuato cristallografia a raggi x o NMR) per risalire ai residui amminoacidici che fanno parte degli hot spot di interazione. Tutto ci) è abbastanza complesso, per cui di solito per i complessi ternari si fa coimmunoprecipitazione, per evitare falsi positivi o falsi negativi. Fare un “three hybrid assay” implica che i 4 vettori plasmidici debbano entrare tutti all’interno della stessa cellula, per cui dobbiamo superare la barriera della membrana plasmatica. Ci) gi& è complicato per i tre plasmidi ricombinanti del saggio diibrido (difficolt& di coinfezione). Posso comunque verificare l’avvenuta transfezione facendo western blotting su una aliquota. N.B. se non entra il plasmide del reporter avremo un falso negativo e le proteine interagiscono. Si fanno controlli positivi anche con Gal4 integro nelle cellule di lievito....