UE2 - Cours 9 - Appareil de Golgi (Hourioux) . PDF PDF

Title UE2 - Cours 9 - Appareil de Golgi (Hourioux) . PDF
Course Paces - ue 2
Institution Université de Tours
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pr hourioux...


Description

L'appareil de Golgi I. Introduction : Il a été découvert à la fin du XIXe siècle par Camillo Golgi (chercheur italien). Il travaillait sur des animaux : des chouettes. Plus particulièrement sur des cellules du cervelet de la chouette : les cellules de Purkinje. Il a décrit des structures réticulées présentes en périphérie dans la cellule. En faisant des imprégnations argentiques, il a découvert une sorte de réseau dans la cellule qui a l'époque a été appelé "l'appareil réticulaire interne" Réticulaire fait appel à RE hors le Golgi n'est pas le RE, donc on a rapidement parler d'appareil de Golgi. Entre le Golgi et le noyau se trouve le RE. Il y a donc une organisation (= filiation) : noyau (transcription) --> RE avec les ribosomes (traduction) --> Golgi (modifications) --> Membrane plasmique et organites (exportations). Mais cette organisation dépend beaucoup du type cellulaire. Cet organite est présent dans tous les eucaryotes 1. Les rôles du Golgi : C'est bien plus tard qu'on a trouvé le rôle du Golgi avec l'intervention de Palade. Au contraire du RE qui a un rôle dans la synthèse, le Golgi a un rôle de modification des protéines, des lipides, des sucres qui viennent du RE. A la sortie de l'appareil de Golgi, l'ensemble de ces molécules est exporté (mb p ou lysosomes) : cette exportation ne se fait pas n'importe comment : on a une plateforme de tri. a) l'action du Golgi sur les protéines : Dans le Golgi il y a une modification séquentiel des protéines qui ont été synthétisées et se sont retrouvées dans le RE. Il peut y avoir : * Des additions de chaines glycosylées (ou modification), d'acides gras, de sulfates... * Des coupures protéolytiques. Elles permettent aux protéines de devenir mature (exemple de l'insuline dans la suite du cours) Le golgi modifie les sucres des protéines N-glycosylées La N-glycosylation commence dans le RE mais elle n'y est pas finie b) l'action du Golgi sur les lipides : Les lipides obtiennnent leur caractéristique de glycosylation que dans le Golgi (alors qu'ils sont pour la plupart des phosphlipides synthétisés dans le RE). Il n'y a pas de glycosylation des lipides dans le RE. Il y a donc beaucoup d'enzymes dans le Golgi et elles sont très spécifiques Golgi = structure particulièrement organisée, ces modifications se font dans un ordre bien précis. On peut retrouver cet ordre dans la structure de l'appareil de Golgi 2. Description du Golgi C'est un empilement de citernes. Chacune des citernes est responsable de certaines réactions et ainsi de manière spécifique. Les enzymes présentent dans chaque citerne sont spécifiques à la citerne.

Ainsi dans chaque citerne il y a certains types d'enzymes responsables des réactions qui leur sont spécifiques. Dans chaque citerne il y a donc des réactions qui s'y déroule mais elles ont lieu que dans cette citerne et pas dans les autres. Le passage de citerne en citerne conduit aux modifications de la protéine de manière successive. Les modifications se font par ordre séquentiel. Le fait que le Golgi soit un empilement de citernes permet d'individualiser les réactions. Elles peuvent donc se faire successivement. On peut associer le Golgi a une chaîne de fabrication de voiture. On le fait dans un sens précis : il n'y a pas tout en même temps. C'est pareil pour la modification des protéines elle se fait selon un ordre très précis.

a) le Golgi un empilement en pile d'assiettes : L'empilement de citernes ne se fait pas n'importe comment. Il est organisé grâce à des interactions du Golgi avec le cytosquelette et surtout avec les microtubules. En effet, quand on dépolymérise les microtubules on désorganise la structuration en pile d'assiettes du Golgi. Les premières citernes sont associées à la modification séquentielle des protéines et des lipides alors que la dernière citerne est une plateforme de tri : elle envoie les vésicules aux différents endroits. Ex : les vésicules à hydrolase : formées à la sortie du Golgi elle a des hydrolases lysosomales et la vésicule est de type clathrine. Il y a 3 types de vésicules : Le golgi a un trafic vésiculaire important. C'est un trafic linéaire (organite polarisé) * Le Cis Golgi : (CGN) C'est la première citerne du Golgi elle est en interaction avec le RE. Il est composée d'une seule citerne. Il sert à l'accueil des nouvelles molécules à modifier. * Le Trans Golgi : (TGN) C'est la plateforme de tri. Il est composée d'une seule citerne.

* Le Golgi médian : Il se trouve entre le Trans et le Cis golgi. Il est composé d'un nombre variable de citernes. On parle de fonctionnement polarisé. Il y a une zone d'entrée et une de sortie. Les hydrolases partent du trans-golgi. (Double flèche = recyclage) CopI : régénération de la membrane plasmique : pas de recyclage. Les vésicules de sécrétions sont formées grâce à des vésicules à clatherine. On voit vaguement l'appareil de golgi en MO. Aujourd'hui, gène de fusion (GFP) ou anticorps contre certaines protéines de l'appareil de golgi) Quand on observe en MET on observe rarement l'appareil de Golgi sous sa forme de pile d'assiettes (à cause des coupes ultrafine). Il est alors plus difficile à identifier. En MET, on obtient des images en 2D, on fait des coupes sériées et par reconstruction en 3D on peut observer le Golgi sous sa forme tridimensionnelle. On voit alors un dictyosome (terme très ancien). C'est une unité de l'appareil de Golgi. Dans la cellule, le Golgi est un ensemble de dictyosomes : il y a plusieurs empilements de citernes. Ces citernes sont aussi reliées par des ponts. Ces vésicules à clathrine sont toujours situées sur la face de départ des molécules (TGN). on retrouve ces vésicules en cas de sécrétions contrôlées ou des sécrétions d'hydrolases. Un trafic vésiculaire implique des guides, il s'appuie ainsi sur le cytosquelette. On retrouve des molécules qui interagissent à la fois avec les vésicules et avec le cytosquelette = protéines motrices (myosine, kinésine et dynéine) Le trafic RE-Golgi se fait préférentiellement avec les microtubules (intervention de dynéine et de kinésine) : on s'en est aperçu en incubant des cellules avec de la colchicine. On retrouve à proximité du Golgi la présence des centrioles. C'est de ces centrioles que partent les microtubules et leur proximité avec le Golgi montre bien qu'ils permettent aux citernes d'être empilées (= organisation spatiale de l'appareil de Golgi : lien entre microtubules et citernes du golgi). Il y a un trafic vésiculaire intense on observe donc un nombre important de vésicules. Certaines cavités du Golgi sont plus dilatées que d'autres. La structure du Golgi dépend du type cellulaire.

L'organisation de l'appareil de Golgi fait que le trans golgi est plutot tourné vers le pole apical de la cellule (c'est le role des microtubules de maintenir cette organisation). Golgi : Beaucoup d'enzymes différentes (peut s'identifier avec des Ac ou en mettant en évidence ces enzymes en les faisant travailler in vitro). On peut également utiliser le fractionnement cellulaire : Vésicules lisses = REL + Golgi (mais ce problème peut etre contourné) b) Interaction du Golgi avec les organites : * Avec le RE : Dans les deux sens : apports des protéines et des lipides qui ont été synthétisé dans le RE (grâce aux vésicules COPII) mais aussi le recyclage des protéines résidentes du RE (grâce aux vésicules COPI) * Avec les compartiments de dégradation de la cellule : endosome, lysosomes... Le trafic vésiculaire se fait aussi dans les 2 sens. En effet, ce sont des vésicules à clathrin qui permettent d'exporter vers ces organites. Il y a recyclage vers le Trans Golgi des récepteurs de ces vésicules.

II. La glycosylation Dans le RE il y a que la N-glycosylation qui se fait.

Il y a aussi de la glycosylation dans le Golgi elle est de 3 types : * Modifications des motifs de la N-glycosylation * O-glycosylation sur les protéines : on les retrouve sur les protéoglycanes * Glycosylation des lipides Il y a aussi des protéines qui sont glycosylées dans le cytoplasme. C'est de la O-glycosylation elle se fait par exemple sur la protéine myc. Cette glycosylation est tout à fait particulière (O-glycosylation) sur des AA de type Sérine ou Thréonine, mais meme si c'est de la O-glycosylation, elle est très différente de ce qui se passe dans le Golgi. Déroulement de cette glycosylation cytoplasmique : Il y a des glycosyles transferases comme la N-acétylglucosamine transférase. Cette enzyme joue le rôle de scanner de la protéine, elle reconnait le motif de la O-glycosylation riche en un certain AA.

Quand le motif a été trouvé il y a transfert d'UNE seule molécule de N-acétylglucosamine. Ainsi, la glycosylation dans le cytoplasme conduit à l'ajout d'une seule molécule de sucre et c'est tout. Jamais de chaines sucrées ramifiées ou linéaires. Rôle de la glycosylation cytoplasmique : Cela pourrait réguler l'action de certaines enzymes, comme la kinase ou l'ARNase polymérase 2 On en retrouve sur myc et sur la p53 ou sur des protéines du cytosquelette (β-caténine). Elle pourrait aussi jouer un rôle sur la stabilité des protéines. Certaines protéines virales sont O-glycosylées (avantage pour le virus) On ne sait pas très bien à quoi elle sert elle est présente sur des kinases , sur l'ARN polymérase 2, βcaténine cette protéine intervient dans le cytosquelette et dans la signalisation on parle de protéine modulable. On a remarqué que les protéines qui sont glycosylées sont des protéines qui rentrent dans la signalisation cellulaire. On pense qu'il y a de la C-glycosylation. Elle a lieu sur un atome de carbone.

O glycosylation dans le Golgi : donne naissance à des glycoprotéines (chaines pas très très longues) 2eme type de protéines avec de très longues chaines non ramifiées de sucres : protéoglycanes (exportés à al surface des cellules et constituent le cell coat) L'étude de tout ce qui touche à la glycosylation s'appelle la glycobiologie. Il y a, chez les chercheurs, un fort développement de l'intérêt de la glycosylation.

III. Les différentes méthodes de détections des constituants du Golgi : 1. La mise en évidence des sucres dans l'appareil de Golgi : par la réaction de PATAg

Ce n'est pas très dur de mettre en évidence les sucres : On utilise la réaction PATAg ou de Thierry. L'objectif de cette réaction est de former un précipité d'argent au dessus des molécules sucrées pour ainsi pouvoir les localiser.

On utilise 3 réactifs (on les ajoute successivement) : * Acide périodique (PA) * Thiocarbo-hydrazide (T) * Protéinate d'argent (Ag) 1) l'acide périodique : Il y a une double action : il rompt les chaines cycliques de sucres formant alors des fonctions aldéhyde. Oxydation des polysaccharides qui va rompre les cycles de sucres et former des fonctions aldéhyde (très réactives) 2) la thiocarbo-hydrazide : Elle réagit avec les fonctions aldéhydes. Elle se fixe sur ces fonctions. 3) le protéinate d'argent : Il se fixe là où se trouve la thiocarbo-hydrazide. Il y a alors formation d'un précipité d'argent qui est opaque aux électrons donc visible en MET. On remarque que plus on s'éloigne du RE plus c'est opaque donc plus c'est concentré en sucres. On voit bien qu'au niveau des vésicules d'exportation la concentration est maximale. On le fait sur une cellule de levure, on voit bien les vésicules et les citernes avec les sucres à l'intérieur mais aussi à la surface de la cellule. C'est les sucre qui ont été exporté à la membrane plasmique et qui forment alors un manteau de sucres. on fait réagir les motifs de N-glycosylation, mais ils sont peu denses et ils ne sont donc pas très denses aux électrons. 2. La détection des enzymes : Pour pouvoir détecter une enzyme il faut la faire fonctionner on fait des réactions biochimiques. Pour les autres constituants on peut faire des détections classiques. Il serait assez compliqué de mettre en évidence toutes les enzymes du Golgi. Exemple de la détection des phosphatases acides. C'est possible car elle est très fortement concentrée et facilement activable. Elles ne fonctionnent qu'en pH acide. Ce pH est présent que dans le lysosome. Ainsi, elles sont inactives dans le Golgi. Toutes les hydrolases qui sont exportées vers le lysosome ou les endosomes ne fonctionnent qu'à pH acide. La cellule a développé cela au cours de l'évolution, ça assure une sécurité pour la cellule : le pH de l'appareil de golgi permet de modifier les hydrolases sans qu'elles soient actives. Ce n'est que lorsqu'il y a exportation ves les lysosomes (pH acide) qu'on va avoir activation des hydrolases. On prend des celulles, on les tue, on les incube dans une solution de pH acide ce qui permet d'acidifier tous les compartiments de la cellule. Ce qui permet de faire travailler les phosphatases acides.

On va pouvoir faire fonctionner l'enzyme, on lui donne son substrat : (bêta)glycérolphosphate. L'enzyme le transforme en acide phosphorique qui est un liquide transparent (non observable en ME). Pour le détecter on utilise une solution de nitrate de plomb elle sert à faire des précipités de plomb. Ces précipités se trouvent uniquement où se trouvent l'acide phosphorique. On met en évidence que les précipités se trouvent qu'au trans Golgi. Cela ne veut pas dire que les phosphatases acides sont présentes que dans cette citerne !! (Mais dans les autres citernes les phosphatases acides sont immatures) Ces enzymes sont synthétisées dans le RE (à ne pas oublier toutes les protéines qu'on trouve dans le Golgi ont été synthétisées dans le RE). Elles subissent différentes étapes de maturation dans le Golgi pour donner la forme mature de l'enzyme (celle qui est capable de faire les réactions) Cette forme mature est présente que dans le Trans Golgi mais elle n'est pas active. En effet, le pH du golgi n'est pas acide elle ne peut pas donc pas fonctionner dans le Golgi. Cela montre qu'il y a plusieurs étapes de maturation qui se font dans le Golgi. 3. Le fractionnement cellulaire :

On lyse les cellules, on les broie, on obtient la fraction microsomale. Cette fraction contient de la membrane du REG (avec des ribosomes) et des membranes du Golgi et du REL c'est le composante lisse de la fraction. (cf cours RE). Avec cette technique on ne peut pas individualiser la membrane du Golgi de celle du REL. Il existe une technique pour remédier à ça : C'est une technique plus douce. On fait la lyse en dehors d'un broyeur puis on réalise un broyage doux. On arrive à conserver la structure du Golgi. on obtient des piles de saccules. Ce sont ces purifications très propres qui ont permis de déterminer la composition du Golgi.

Le Golgi est composé majoritairement d'enzymes nécessaires aux mécanismes de modifications. Ces enzymes sont différentes par leur nature. Mais le type d'enzyme est dépendant du type cellulaire. Leur site catalytique est tourné vers la lumière du Golgi. Membrane du golgi intermédiaire entre membrane du RE et membrane plasmique : début de saturation des phospholipides avec une augmentation de l'épaisseur, augmentation du taux de cholestérol, phénomène de glycosylation et formation de la sphingomyéline. Les rafts lipidiques commencent à se former dans le Golgi

IV. Les modifications des motifs de glycosylation : 1. Modifications de la N-glycosylation : Les modifications dans le Golgi permet l'élongation et la teminaison des chaines de Nglycosylation. Ces modifications se font dans un ordre séquentiel.

Dans un premier temps (2 sur le schéma) il y a action d'une Golgi mannosidase I (ce n'est pas la même que celle qui est présente dans le RE). Elle enlève des résidus mannose.

Dans un 2ème temps (3 sur le schéma) il y a transfert d'une molécule de N-acétylglucosamine grâce à la N-acétylglucosamine transférase I. C'est le signal d'intervention de la Golgi mannosidase II. Puis il y a une mannosidase II qui intervient (4 sur le schéma). Elle enlève encore des résidus mannose. Ensuite il y a ajout d'autres molécules de N-acétylglucosamine. Enfin il y a ajout de galactose sur ces molécules de N-actéylglucosamine. Et sur les galactose il y a transfert de molécules d' acide sialique ou NANA. Ainsi, dans le Golgi la chaine de sucres subie : * Départ de mannose * Un transfert de N-acétylglucosamine * Une 2ème départ de mannose * Un 2ème transfert de N-acétylglucosamine * L'ajout de molécule de galactose * Un transfert de molécule NANA Ce ne sont pas des molécules seules qui sont utilisées mais des molécules couplées à des nucléotides (qui sont reconnues par des perméases) : Ces molécules sont activées, c'est la même chose que pour le RE. Contrairement au RE tout se passe dans les citernes. Il y a l'implication de glucosyltransférases spécifiques d'un sucre. Action sur cette chaine de glycosylation par les traitements lors d'une infection au VIH : AZT c'est l'une des premières molécules qui a été utilisé pour traiter des infections virale et en particulier le VIH. Cette AZT mime une base nucléotidique. La rétropolymérase du génome du VIH (transcriptase inverse) elle transforme l'ARN viral en ADN. Elle est chargée de multiplier le génome viral. Elle utilise des nucléotides cellulaires pour recopier du génome. Quand on traite à l'AZT on espère que la transcriptase inverse va prendre l'AZT. Cette molécule est alors incorporée. La rétrotranscription s'arrête immédiatement l'enzyme ne peut rajouter un nucléotide. Ainsi, l'AZT appartient aux analogues nucléotidiques.

Ce traitement a des effets secondaires chez les patients. L'activation des sucres se fait par des nucléotides (UDP ...). Ce sont les perméases qui permettent d'importer les nucléotides. Cette AZT va se fixer sur les perméases elle bloque la perméase elle empêche l'apport de sucres dans le Golgi.

2. La O-glycosylation : Cette glycosylation se fait sur un atome d'oxygène présent dans des sérines et des thréonines. Ce sont leur fonction OH qui vont être utilisées. La C-glycosylation concerne le tryptophane L'étude des suces est la glycobiologie.

Il y a des glycosyltransférases qui sont chargées d'ajouter des sucres sur ses acides aminés formant des chaines ramifiées ou non. Avec l'étude des gènes on se rend compte que les glycosyltransférases sont très importantes et nombreuses : 1% de notre génome code pour ces enzymes. La O-glycosylation peut être de 2 types : * Soit la chaine est ramifiée * Soit la chaine est linéaire Pour les glycoprotéines les chaines sont ramifiées Alors que pour les protéoglycanes (qui sont constitués de GAG) les chaines de sucres sont linéaires : elles ne sont pas ramifiées. Ce qui oriente vers des chaines ramifiées ou non : Il y a des motifs spécifiques (3 à 4 sucres) présents sur la protéine ils permettent de guider pour avoir une chaine ramifiée ou linéaire. Dans le cas des protéoglycanes on parle de motif tétra (20) Ces motifs ne sont pas tous connus. Ils concernent des domaines longs des protéines.

Les étapes pour mettre en place une chaîne de sucre de type O-glycosylé : 1) reconnaissance des motifs 2) ajout de 1 à 4 sucres de manière séquentiel. Ces sucres constituent un motif pour orienter vers la synthèse d'un protéoglycane ou vers une glycoprotéine. Pour les protéines à domaine EGF (glycoprotéines) le motif est un enchainement de 3 sucres. Alors que pour les protéoglycanes c'est un motif à 4 sucres

Pour les protéoglycanes les ajouts de sucres se fait par des molécules disaccharidiques. Les sucres sont liés par des ponts. Le motif de base est donc un disaccharide. Mais il y a pas que 2 sucres sur la chaîne : la chaîne est constituée d'un ensemble de 2 sucres qui se succèdent. Alors que pour les glycoprotéines la constitution de la chaine se fait par ajout de monosaccharide.

Protéoglycanes --> Disaccharide = on ajoute les sucres sous forme de dimères Glycoprotéine --> Monosaccharide

Chaine très longue car elle participe à l'établissement du cell coat qui protège par exemple les cellules épithéliales, et participent également à la matrice extracellulaire. La spécificité de chacun de ces motifs est lié à de très nbses glycosyltransférases différentes, chacune étant chargée d'additionner tel ou tel sucre

3. La glycosylation du collagène : Elle se fait sur des résidus différents des autres glycosylation. Elle a lieu sur des hydroxylysines.

4. La ...


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