UE2 - Cours 1 Méthodes d\'études en biologie cellulaire . PDF PDF

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cours intro et méthode d'exploration, pr. hourioux...

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UE2 : Cellules et Tissus Cours 1 : Méthodes d'études en Biologie Cellulaire 1. Introduction à la biologie cellulaire La vie sur Terre : * 10 à 100 millions d'espèces vivantes --> De nouvelles découvertes

(entre 10k et 20k chaque année (estimation basse : on a découvert une espèce sur 10) Les activités humaines sur la Terre sont négatives sur l'écologie et la biodiversité, cette activité est responsable de la disparition d'un grand nombre d'espèce à une vitesse accélérée. => Des espèces vivantes disparaissent avant meme que l'on est pu les caractériser. * Origine de la vie estimée à -3,5/4 milliards d'années (Les fossiles ne possèdent pas de matière organique : difficile à dater) * Tous les organismes naissent à partir d'un parent => Hérédité (Que ce soit les etres unicellulaires ou les etres pluricellulaires) * La plus grande partie des organismes sont unicellulaires (cellules simples ou évoluées) Donc les organismes (comme nous) constitués de plusieurs cellules sont les moins nombreux sur Terre. * Organisation commune des êtres vivants => C'est la cellule !

Support de l'hérédité : l'ADN --> Universel (aucune exception) * Toutes les formes de vie sans exception utilisent le même code héréditaire : l'ADN (le génome) * ADN : code à 4 lettres A, T, G, C * ADN peut être échangé (naturellement ou artificiellement) entre espèces vivantes

Chaque organisme est fait de cellules Chaque cellule est faite d'ADN (A, T, G, C) L'ADN permet une transmission fidèle de cellule mère à fille, c'est le plan de montage, de fonctionnement de la cellule.

Transfert d'ADN : entre différentes espèces vivantes :

Virus = parasite : pas de vrais êtres vivants, ne peuvent pas se reproduire sans cellules. Il existe de très nombreux virus : certains sont à ADN, d'autres sont à ARN. Les virus infectent les cellules pour se multiplier. Analyse génome humain : 10% de séqueces d'origine virale (utiles à l'être humain) -> Evolution de l'Homme => Sélection naturelle de gènes viraux qui deviennent à part entière des gènes cellulaires.

ADN plasmidique = ADN circulaire plasmidique En laboratoire : expérience de biologie moléculaire : on utilise les virus et les bactéries (elles ont un chromosome = ADN bactérien) La bactérie peut héberger un ADN plasmidique (utilisé en labo) que l'on peut purifier et qui contient les gènes que l'on souhaite étudier. Ce plasmide est pris en charge par la cellule et la protéine est produite à partir du gène qui nous intéresse.

La transmission artificielle se fait dans les labos et de plus en plus dans les thérapies géniques. Thérapies géniques : on utilise des virus modifié (aucun pouvoir pathogène, ni réplication, ni duplication) => On détourne la voie naturelle du virus.

ADN : support de l'hérédité :

ADN = double brins qui se séparent : une copie de chaque brin est transmis + reconstitution du 2ème brin. Reproduction très fidèle : Rares erreurs Molécule de stockage de l'information génétique, excessivement stable et résistante. On en retrouve des années après (ex : test de paternité, affaires criminelles (même très anciennes), lignées historiques...)

Comment s'exprime l'information contenue dans l'ADN ?

Transcription : découverte en 1965, quelques années après la découverte de la structure de l'ADN => Les connaissances liées à l'ADN sont très récentes Toutes les cellules utilisent les mêmes constituants : sucres, AA (constituants

des protéines), lipides, nucléotides...

Toutes les cellules sont entourée d'une membrane plasmique : Structure en bicouche lipidique, présence de lipides particuliers (= Les Phospholipides) : Formation d'un film en surface de l'eau. Cette organisation peut être perturbée (agitation) => formation d'une bicouche Les lipides permettent aux cellules de s'isoler du milieu extérieur : Structure alternative = Lysosomes * Maintien et protection de l'intégrité de la cellule * Séquestration des éléments cellulaires dans un même lieu * Maintien de conditions intracellulaires propices à la vie (homéostasie cellulaire = Maintien d'équilibre constant) => Régulation des concentrations en ions et

protéines pour que la cellule survive dans son environnement. * Filtre sélectif : - Capture de nutriments - Elimination des déchets

Architecture de la membrane (= Lipides + Protéines) : protège la cellule du milieu

extérieur --> La vie a pris de multiples formes sur Terre : * La compléxité (et la diversité) d'une cellule dépend du nombre de gènes : --> Bactérie simple : 480 gènes et ~ 600.000 nucléotides Evolution de cellule procaryote à cellule eucaryote --> Cellule humaine : 20.000 à 30.000 gènes et ~ 3,2 milliards de nucléotides

Evolution chez les procaryotes --> Contenu en ADN pas forcément corrélé au développement de l'organisme (organisme primitif, inférieur/supérieur)

3 grands domaines : - Bactéries - Archébactéries - Eucaryotes (Eucaryotes unicellulaires = Protistes)

Prion = 1 protéine, pas une cellule => Pas d'autoreproduction

MO : entre insectes et bactéries => On ne voit pas les virus ME : De la cellule à la protéine => On ne voit pas les molécules Analyse rayons X : On voit la structure de protéines, des molécules et des atomes.

Procaryote ~ 1 chromosome mais plutôt de l'ADN circulaire Cholestérol dans les cellules animales (sauf membrane interne de la mitochondrie) Les cellules eucaryotes possèdent un système de membranes internes qui délimite des compartiments dans la cellule (= organites) Fonction du système de membranes internes : * Isolement des différentes fonctions de la cellule - >> compartimentalisation structure / fonction - >> isoler / séparer les réactions biochimiques de la cellule (ex : synthèse protéique dégradation protéique)

* Augmentation de la surface de membrane : - >> de nombreuses enzymes cellulaires ont besoin d'un ancrage sur une membrane * Création de gradients électrochimiques au sein des membranes (mitochondries)

La cellule a développé des systèmes de transports complexes entre compartiments. * Membrane interne permet à la cellule eucaryote de réaliser des réactions biochimiques beaucoup plus complexes et surtout une régulation des concentrations, c'est lié au fait que les fonctions majeures sont isolées (ex : génome isolé dans noyau) On parle de compartimentalisation : elle évite que 2 réactions antagonistes au même endroit - Augmentation des surfaces de membrane (beaucoup d'enzymes) - Création de gradient électrochimique au sein des membranes (mitochondries) => La cellule a développé des systèmes de transports complexes entre compartiments : Les membranes constituent un frein au développement mais systèmes de transport mis en place. * Passage procaryote --> Eucaryote : genèse des compartiments intracellulaires

Pas de dégradation des bactéries car elles apportent un avantage à la cellule : Apparition mitochondrie/chloroplaste issu de mécanismes de phagocytose (La cellule phagocyte une bactérie, la bactérie reste dans le cytoplasme et évolue en mitochondrie) --> Mitochondrie + chloroplaste : possèdent 2 membranes (la normale et celle ingérée) --> Dans les mitochondries et les chloroplastes : présence d'ADN circulaire similaire à l'ADN procaryote (L'étude de la séquence de cet ADN montre qu'il est très proche de l'ADN bactérien) Pour le développement des autres organites, on ne sait pas de façon certaine mais "création de membrane pour individualiser les fonctions". Mais on pense qu'il y a des replis membranaires qui se sont créer au sein de la membrane plasmique pour individualiser des fonctions cellulaires, ils augmentent au cours de l'évolution jusqu'à s'individualiser pour former des compartiments autonomes au sein de la cellule.

Premières cellules = origine de la vie ? Personnes n'a réussi à recréer la vie dans un tube à essai, la vie c'est quelque chose de complexe. La vie = autoreproduction

Autoréplication = action enzymatique capable de dupliquer un organisme à l'identique

=> Problème de transmission des caractères

Les premières molécules de la vie : AA, Lipides, Acides nucléiques (= ADN + ARN) >> Hypothèse : L'ARN comme premières molécules de la vie - car cet ARN est constitué d'une séquence génétique, il pourrait donc etre un support de l'hérédité. - certains ARN sont capables d'avoir des fonctions enzymatiques Les origines de la vie : * "La main de Dieu(x)" * Génération spontanée (Pasteur)

* Atmosphère réductrice : expérience de Miller (1953)

* Failles volcaniques sous marines : Ces failles possèdent des tempréatures très

très élevées + présence d'éléments qui permettent la formation de la vie (Carbone, Soufre..) Mais 350° --> incompatible avec la vie (max 90-100°C)

* Météorites (contamination venue de l'espace) : Il y a des lipides, des AA =>

50 à 100 tonnes qui arrivent chaque jour sur Terre. LUCA (Last Universal Common Ancestor) : la première cellule

Fossiles présents dans les roches (Groenland, Australie) --> Absence de matériel génétique Avec bioinformatique : évolution (au hasard) du matériel génétique d'une cellule 3,5 milliard d'années d'évolution des génomes :

L'évolution se fait par modification de l'ADN, il arrive (très rarement) que des mutations se produisent. (Effet positif = sélection naturelle / Effet négatif = disparition) AVANT : pour un gène, une seule copie MAINTENANT : duplication de gènes et évolution indépendante => Famille de gènes Conséquences de l'évolution :

Peu d'évolution = peu tolérant aux mutations --> La conservation est essentielle (par exemple : l'actine est essentielle et optimale) Forte évolution --> On ne remonte pas aux gènes d'origines Hypothèse d'un monde ancestral à ARN

* environ 80 protéines universelles héritées de LUCA, * 80% de ces protéines liées à des fonctions de l'ARN

Conclusions : --> émergence de différentes formes de vie puis sélection ? --> Rôle des virus dans l'évolution --> Découverte récente de bactéries "particulières" --> Et le sexe dans tout ça ??

Procaryote --> asexué --> Absence de brassage génétique --> Absence d'évolution (mais beaucoup plus simple) Eucaryote --> Reproduction sexuée --> Beaucoup de brassage génétique (contribue à l'évolution d'une espèce)

2. Les techniques et les différents types de microscopie Bref historique : Evolution avec les progrès technologiques

C'est dans les années 1600 qu'on a commencé à étudier les cellules vivantes. * Premiers microscopes optiques : Cellule végétale, spermatozoïdes et petits insectes => Beaucoup d'évolution sur la MO * Biochimie : peu de progrès entre 1800 et 1900 * ME : observation de l'ADN et des virus (les premiers ME avant la 1ere guerre mondiale --> permettent de visualiser la cellule, éventuellement la molécule d'ADN) * Biologie moléculaire => Comprendre le fonctionnement cellulaire à l'échelle moléculaire Au travers de la biologie moléculaire, on a compris comment marchait les gènes. On a mis 10 ans à séquencer le génome humain, aujourd'hui en 1 semaine on peut séquencer 4 ou 5 génomes humains.

A. La microscopie optique Pas de photos mais des gravure (Hooke et Van Leeuwenhoek)

* Un peu de théorie .. : Lumière = Onde ondulatoire (=> Diffraction) caractérisé par la longueur d'onde

* Diffraction : s'observe dès que la lumière rencontre un obstacle --> Apparition de tâche de diffraction liée aux ondes de diffraction => Limite de résolution

* Limite de résolution : 0,2µm (pouvoir séparateur, varie avec la longueur d'onde) --> On voit facilement le noyau mais pas le reste (RE, Golgi,...) Les plus petites bactéries font 1µm = limite de l'observation en MO.

Avantages : Permet une vision en couleur (la seule microscopie) : Facile et rapide de préparer les cellules à observer (utilisation en laboratoire) : La lumière possède un pouvoir de pénétration important --> Observation de la cellule dans toute son épaisseur : On peut observer une cellule vivante --> Voir le métabolisme => MO classique : pour étude des tissus --> Histologie (celle qu'on retrouve à l'hôpital)

=> MO confocale : la plus performante

=> MO à contraste de phase : aucune coloration, observation directe --> Lumière où toutes les ondes sont en phase. MO dynamique qui permet d'étudier des cellules vivantes.

- Onde en phase : blanc - Décalage de phase : gris - Opposition de phase : noir ou gris foncé => MO classique : dans les laboratoires d'analyse pathologique et à l'hopital * Cycle de préparation : - la chirurgie enlève un morceau d'organe = Exérèse ou biopsie - Pour la fixation on utilise une molécule très longue avec des fonctions réactives --> fixe les éléments de la cellules entre eux pour les conserver => Mort de la cellule - Deshydratation (lente) : remplacement de l'eau par un solvant (alcool/acétone) => un solvant est plus facile à manipuler que l'eau - On trempe la biopsie dans la paraffine, la paraffine prend la place du solvant : on obtient un bloc de paraffine - Le bloc de paraffine est coupé par un microtome --> Coupes semi-fines : 2 à 5 µm - Déparaffinage avec solvant - Observation

Technique d'observation qui prend au minimum une journée :

Technique alternative (cas d'urgence) : congélation instantanée --> Coupe avec un cryomicrotome --> Observation directe Durée approximative : ~ 10 à 15 min

--> Cellule polarisée (dans épithélium : pole basal et pole apical) B. Marquages et colorations : a) Utilisation d'anticorps

* Utilisation d'anticorps marqué (immuno-marquages) : détournement des fonctions naturelles pour la microscopie (détection de protéines) - Direct : Ac spécifique de cette protéine auquel on a fixé un marqueur =>

L'anticorps se fixe sur la protéine --> Position de la protéine MAIS parfois l'Ac ne reconnait pas que la protéine --> On voit la protéine qui nous intéresse + autre chose (bruits de fond : les Ac se fixent ailleurs dans la cellule)

- Indirect : Le plus utilisés dans les laboratoires. Combinaison de 2 Ac : Plus fiable, plusieurs marqueurs pour une protéine => Amplification du signal * Ac primaire (non marqué) reconnait la protéine * Ac secondaire marqué reconnait l'Ac primaire. 1er avantage : Amplification du signal (plusieurs Ac pour une protéine) 2eme avantage : On peut choisir un anticorps secondaire avec une molécule marqueur ou une autre => On peut changer de molécules marqueurs.

* Les molécules marqueurs :

- Enzyme : en présence d'un substrat incolore, l'enzyme le transforme en produit coloré => Immuno-peroxydase --> Le plus souvent utilisé - Molécule fluorescente : En l'absence de lumière d'excitation, cette molécule n'est pas visible au microscope mais quand on excite le marqueur par une lumière, il y a une émission de lumière => Immunofluorescence L'excitation a toujours une longueur d'onde plus petite. - Immunogold : Bille d'or + Ac : la bille d'or (métal lourd) arrête les électrons --> Point noir en ME et point rouge en MO * Les anticorps : molécules naturelles

--> On les obtient par vaccination/immunisation --> Stimulation du système immunitaire pour un Ac particulier --> Pour l'Ac primaire : injection de la protéine purifiée dans la seringue à la souris --> attente de plusieurs semaines --> Prélèvement du sang de la souris --> Purification des Ac spécifiques --> L'essentiel est de savoir de quelle espèce vient l'Ac primaire --> On vaccine une autre espèce : les immunoglobulines sont reconnus comme étranger => Ac secondaire (après plusieurs semaines => Purification) --> Pour finir il faut ajouter le marqueur sur l'Ac secondaire.

Ac dirigé contre une protéine = Ac anti-protéine = l'Ac reconnait la protéine * 2 protéines à reconnaitre => 2 Ac primaire de 2 espèces différentes => 2 Ac secondaires spécifiques Les Ac (très grosses molécules) ne peuvent pas traverser la membrane plasmique => Perméabilisation de la membrane (= petits trous dans la membrane faits par des molécules de type savon, ce qui entraine la mort de la cellule) Ces petits trous permettent la diffusion des anticorps dans la cellule. Pour visualiser des protéines intracellulaires, il faut perméabiliser la membrane ce qui entraine la mort de la cellule. On peut visualiser, à l'aide des anticorps, des protéines de surfaces sans tuer la cellule.

* Observation d'un co-marquage en immunofluorescence : UV --> Bleu (488 nm) --> Vert (546 nm) Exemple : DAPI --> Excité dans le domaine des UV --> Emission d'une lumière bleue Fluoresceine = FITC (excitation avec une lumière bleue et la réémission de fait dans le vert)

Rhodamine excitée par une lumière verte --> Emission d'une fluorescence rouge --> Détection d'une ou plusieurs protéines spécifiques La longueur d'onde d'émission est supérieure à la longueur d'onde d'excitation * Peroxydase : sur le pole apical (Protéines d'adhésion des épithéliums) : La fluorescence orange permet de localiser ces protéines d'adhésion (en position apical et non à la base de la cellule) incoloré --> Coloré => Brun-orangé b) Utilisation de gènes de fusion avec la GFP

La GFP ? (Green Fluorescent Protein) * Petite protéine, 238 AA : sa découverte a révolutionné le monde de l'étude * Protéine produite par une méduse => naturelle (récupération du gène de cette protéine, maintenant utilisation classique en biologie moléculaire) * Organisation en tonneau (inactive sous forme de cordelette --> Structure tridimensionnelle active = fluorescente) * Chromophore au centre du tonneau => Responsable de la fluorescence

* Gène GFP introduit et exprimé dans la cellule = cellule fluorescente * Gène de fusion : manipulation des gènes in vitro (dans des tubes) --> Suppression du codon stop de la GFP et du codon start de la protéine à étudier --> Fusion des 2 gènes grâce aux enzymes (polymérase ou ligases) --> Une seule protéine de fusion : même propriété d'origine + GFP fluorescente mais parfois la protéine perd des fonctions ou devient toxique pour la cellule. => Dans la cellule : gène de fusion entré de façon artificielle = Transfection La cellule peut être vivante, la protéine remplit sa fonction et on peut alors la localiser grâce à la GFP. Aujourd'hui toutes les couleurs en fluorescence => mutagénèse dirigée sur la GFP. On peut faire des souris transgéniques qui vont naturellement produire cette GFP. La GFP est très utile pour étudier les phénomènes dynamique Modèle animal = poisson zèbre : très utilisé, il a l'avantage d'être transparent => intérieur de l'organisme sous un microscope. c) Utilisation de sondes nucléotidiques

Principe = Recherche d'une séquence très particulière d'un gène (ex : gène du cancer) Sélection de la séquence --> Fabrication d'une sonde (marquée) de cette séquence (entreprise spécialisée) --> Repère sonde lors de l'hybridation in situ --> Perméabilisation de la membrane + dénaturation ADN (Séparation des 2 brins) à haute température (=> Mort de la cellule) --> Lavage --> Observation fluorescence => Technique de FISH (Fluorescent in situ hybridation) Certaines cellules cancéreuses se retrouvent avec une amplification de gènes (5 copies d'un facteur de croissance au lieu de 2 => Beaucoup plus de récepteurs) --> Cassure + réassociation de chromosome => Translocation de gènes --> observable avec les sondes. Si les fluorescences sont distinctes, la cellule est normale. Si les deux fluorescence sont confondues, c'est qu'il y a eu translocation.

C. Microscopie confocale :

Microscopie excessivement précise, à fluorescence, beaucoup plus cher, diaphragme extremement fin et photomultiplicateur (= détecteur très sensible). Lumière d'excitation très fine et très précise = laser (= 1 seule longueur d'onde) Platine qui varie de façon très fine en hauteur => image des tranches de la cellule => Reconstruction en 3D de la cellule.

Lorsqu'on acquiert une image, on acquiert une tranche de la cellule (coupes sériées) par l'informatique on réassemble ces coupes et on obtient une vue...