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L’appareil de Golgi L’appareil de Golgi a été découvert à la fin du XIX ème siècle par un médecin italien, Camillo Golgi (prix Nobel en 1906). Il a développé les techniques de coloration des cellules nerveuses : il fixait des cellules de cervelet de rat puis les imprégnait de nitrate d’argent. Cette expérience lui a permis de mettre en évidence un réseau cytoplasmique ayant une affinité pour le nitrate d’argent (pour les métaux lourds). On a qualifié cette expérience de “réaction noire”. L'existence de cet organite a été contestée puisque d’autres biologistes pensaient qu’il s’agissait d’un artéfact. D’autres encore pensaient qu’il s’agissait de mitochondries. Son existence a été confirmée plus tard par la technique de cryodécapage. Comme le RE, l’appareil de Golgi appartient au système endomembranaire des cellules eucaryotes. Sa position est à proximité du centrosome et donc du noyau, sa localisation est donc périnucléaire. Pour la mettre en évidence, on a utilisé des anticorps dirigés contre une protéine résidente du Golgi et marqués par une molécule fluorescente. Fonctions : C’est un des principaux sites pour la synthèse des glucides : il a une fonction de production de glycoprotéines et de glyocolipides via des modifications post-traductionnelles. De plus, l’ensemble des protéines issues du RE et adressées au Golgi va être réorienté vers d’autres organites ou vers la membrane plasmique, grâce à des motifs spécifiques et via des vésicules. L’appareil de Golgi constitue donc une station de tri et de répartition des protéines. I – Ultrastructure L’appareil de Golgi consiste en un ensemble des dictyosomes. Chaque dictyosome est composé par un empilement de 4 à 6 saccules aplaties (pas toujours bien identifiables). Ces saccules sont limitées par une membrane qui va délimiter une cavité. Ces cavités sont appelées citernes du Golgi. La membrane du Golgi est de l’ordre de 60-70 Å (plus épais que le RE, 55 Å). L’espace luminal est plus important puisqu’il mesure de 20 à 50 nm (comparable à celui de RE). Plusieurs dictyosomes peuvent être réunis par des connexions tubulaires, on considère donc qu’il y a un complexe unique. Le CGN (Cis Golgi Network) pourrait être formé par la fusion des amas tubulo-vésiculaires provenant du RE. L’appareil de Golgi est un organite polarisé. Chaque dictyosome est constitué de 3 compartiments, chacun étant composé d’un ou plusieurs saccule(s) : ● le compartiment cis (entrée) fait face au RE. ● le compartiment médian qui est intermédiaire. ● le compartiment trans (sortie) est lui orienté vers la surface de la cellule (côté membrane plasmique).

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Les cis et trans vont communiquer via un réseau de tubules interconnectés, à l’entrée et à la sortie de l’appareil de Golgi. Le cis Golgi communique avec le RE via un réseau cis golgien = CGN (Cis Golgi Network). Ce réseau est parfois appelé ERGIC, il est dans ce cas considéré comme un compartiment indépendant, intermédiaire entre le RE et le Golgi. Le trans Golgi se prolonge par un réseau trans golgien = TGN (Trans Golgi Network). Cette polarité est essentielle pour la fonctionnalité du Golgi. La mise en évidence des compartiments du Golgi repose sur la détection d’enzymes présentes en plus forte quantité dans certains compartiments (mais non spécifiques de ces compartiments), identifiables par des techniques de coloration : ● cis Golgi : mis en évidence par des sels de métaux lourds (comme le tétroxyde d’osmium). ● Golgi médian : mannosidases. ● trans Golgi : nucléosides diphosphatases. ● réseau transgolgien (TGN) : phosphatases acides. La structure des membranes golgiennes repose sur une ossature d’actine , spectrine et d’ankyrine, en lien avec des microtubules et protéines associées (MAP). Les drogues agissant sur les microtubules perturbent donc son organisation (colchicine, vinblastine). Il y a également des protéines fibreuses appelées “ golgines”, présentes dans la membrane, qui permettent de maintenir les vésicules à proximité des citernes golgiennes. Ces protéines forment une “matrice golgienne”. Elles ont également un rôle dans le désassemblage du Golgi lors de la mitose. Dans le Golgi, qui fait partie du flux vectoriel permanent, on a un trafic de protéines en transit : elles arrivent du RE par la face cis et sortent par la face trans. Ce trafic, qui n’est aujourd’hui pas totalement expliqué, relève de deux théories, qui ne sont pas exclusives. La première théorie est celle d’un transport vésiculaire. Dans cette théorie, on imagine que l’appareil de Golgi est statique et que des vésicules assurent les transports entre les différentes citernes du Golgi. Ce sont des vésicules suivant un flux antérograde (du compartiment cis vers le compartiment médian, puis trans). Dans la deuxième théorie, on imagine qu’il y a une maturation progressive des citernes. Les citernes se déplacent vers la face trans avec les molécules qu’elles contiennent et deviennent matures. Il y aura acidification progressive des citernes par action de H + ATPases. Ces citernes avaient un contenu enzymatique spécifique. Or, dans cette seconde théorie, les citernes maturent et se déplacent, donc il faut imaginer un flux enzymatique rétrograde, qui va ramener les enzymes dans leur compartiment d’origine, ce qui permet le maintien de la distribution de ces enzymes au même endroit (à un pH spécifique nécessaire à leur activité). Cela signifie que les enzymes ne suivent donc pas la maturation et le déplacement des citernes.

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Éléments en faveur d’un système dynamique par maturation progressive des citernes : ●

Certains médicaments agissent sur les microtubules comme la bréfeldine A qui inhibe la formation des vésicules recouvertes de COP II qui assurent un transport antérograde du RE vers le Golgi. Sans l’apport de ces vésicules, le Golgi disparaît rapidement (2 heures environ) : le Golgi ne supporte donc pas un arrêt de son “alimentation” par ces vésicules. Les citernes avancent : on parle de système dynamique.

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Les protéines en transit sont présentes dans les citernes mais absentes des vésicules → elles avanceraient dans les citernes

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Il y a présence d’enzymes golgiennes dans les vésicules. En faveur d’un adressage rétrograde d’enzymes à la citerne précédente.

II – Composition chimique Les protéines du Golgi sont toutes transmembranaires formant des complexes multienzymatiques. Elles assurent ainsi différentes activités enzymatiques : comme les glucosidases, glycosyltransférases (assurent le transfert de sucres), mannosidases (hydrolysent les résidus mannoses) et des phosphotransférases.

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III – Maturation des protéines issues du RE 1 – Transport antérograde du RE au Golgi Ce transport est assuré par des vésicules recouvertes d’un manteau de COP II. Elles se forment au niveau de la zone de transition du REL (entre REG et REL), la zone ERES (= ER exit sites). Le mécanisme de transfert est sélectif, les protéines doivent être correctement repliées et est basé sur l’existence de signaux de reconnaissance appelés signaux de sortie . Dans ces vésicules, on a progressivement une concentration croissante de protéines possédant ce signal de sortie. Lorsqu’elles seront formées, elles pourront migrer vers le Golgi.

Comment les protéines sont-elles emprisonnées dans ces vésicules ? On peut envisager deux situations selon le fait qu’elles soient luminales ou transmembranaires. a – Protéines transmembranaires (flèche rouge) Cette protéine transmembranaire possède un signal de sortie, qui est présent au niveau de son domaine cytosolique. Ce signal de sortie va permettre l’interaction de cette protéine avec des composants du manteau de COP II. b – Protéines luminales/solubles du RE (flèche bleue) Le mécanisme est obligatoirement indirect. Les protéines luminales portent elles aussi un signal de sortie. La protéine luminale interagit avec des récepteurs transmembranaires (vert clair) appelés récepteur de chargement. La liaison de la protéine au récepteur de chargement entraîne son changement de conformation, ce qui lui permet de démasquer le site d’interaction cytosolique avec les composants du manteau de COP II. Par l’intermédiaire du récepteur de chargement, les protéines vont ainsi pouvoir être reconnues et concentrées dans des vésicules recouvertes de COP II. Les récepteurs de chargement sont des lectines qui reconnaissent le motif oligosaccharidique. Un défaut de ERGIC53 (récepteur de chargement) entraîne un défaut d’export des facteurs 5 et 8 de la coagulation, ce qui se traduit par des hémorragies.

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Les protéines résidentes du RE y sont maintenues car : ● Elles n’ont pas de signal de sortie, ● Sont présentes en forte concentration, ce qui favorise la formation de complexes et limite le risque d’être piégées lors de la formation de la vésicule, ● Possèdent un motif de rétention qui permettra un retour via transport rétrograde pour celles qui seraient sorties. c – Mécanisme de sortie Ces vésicules recouvertes de COP II bourgeonnent au niveau de site ERES et se détachent du réticulum, et très rapidement perdent leur revêtement de COP II. Une fois débarrassées de ce manteau, elles vont pouvoir fusionner en amas tubulo-vésiculaires (perte de la forme sphérique) qui vont se déplacer vers le Golgi par un système d’interaction avec les microtubules par l’intermédiaire de protéines motrices. Elles glissent le long des microtubules puis fusionnent avec le réseau cis golgien (CGN), qui est côté RE. Certains auteurs considèrent que ERGIC serait le compartiment intermédiaire à l’origine des vésicules tubulaires (VTC). On observe également des protéines résidentes du RE (flèche noire) qui ne contiennent pas de signal de sortie. L’objectif n’est pas de les adresser au Golgi. Elles ne peuvent pas interagir avec les récepteurs de chargement. Elles sont supposées rester dans la lumière du réticulum.

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2 – Transport rétrograde du Golgi au RE

C’est également un transport vésiculaire sélectif : il concerne les protéines qui possèdent un motif de rétention. La différence avec le transport antérograde est que les vésicules vont êtres recouvertes d’un manteau de COP I. Le transport intervient très rapidement, dès les amas tubulo-vésiculaires. À peine les protéines sont dans le Golgi que déjà s’organise leur retour vers le RE. Ce transport rétrograde va servir à ramener au RE des protéines qui n’étaient pas censées partir vers le Golgi : il y a donc une volonté de maintenir les protéines dans le RE. Ces protéines résidentes du RE n’ont pas de signal de sortie, n’ont pas été recrutées par les vésicules mais ont été piégées dans les vésicules (de façon aspécifique) recouvertes de COP II lors de leur formation. Elles ont cependant un motif de rétention (motif dilysine ou motif KDEL de 4 AA) qui permet de les ramener vers le RE. Le transport rétrograde permet aussi de ramener au RE les récepteurs de chargement qui sont importants pour la sélection des protéines luminales (signal de sortie possédé par des protéines solubles). Ce mécanisme de recapture dépend de motifs spécifiques. On distingue 2 situations, de la même façon que pour le transport antérograde. a – Protéines transmembranaires Le principe de reconnaissance est ici direct. Le motif de reconnaissance/de rétention est un motif dilysine. Ce motif dilysine, présent du côté cytosolique, permet la liaison avec les composants du manteau de COP I, puis le bourgeonnement d’une vésicule. b – Protéines luminales/solubles Il s’agit d’un mécanisme indirect. Elles ne peuvent pas interagir directement avec le manteau de COP I, elles présentent donc un motif de reconnaissance/de rétention KDEL. Les protéines le possédant se lient à des protéines transmembranaires dites “récepteurs KDEL” ( R-KDEL, ce sont des récepteurs de chargement).

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Cette liaison change la configuration de la protéine transmembranaire (R-KDEL) et démasque un motif dilysine qui interagit avec le manteau de COP I (similaire aux récepteurs de chargement au niveau du RE).

c

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Mécanisme de sortie

Une fois formées, les vésicules recouvertes de COP I, repartent vers le RE. Elles fusionnent à la membrane du RE et leur contenu est libéré. Le pH du RE étant supérieur à celui du Golgi, on observe une baisse de l’affinité du R-KDEL pour le KDEL donc la libération du KDEL.

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Zones de contacts réticulum endoplasmique/ trans-Golgi

Les zones de contacts ont lieu entre le réticulum endoplasmique et le trans-Golgi. On pouvait s’attendre à ce que les contacts se fassent avec le cis- Golgi car il est davantage à proximité du réticulum endoplasmique. Or, on a une partie du réticulum endoplasmique qui vient en contact avec la zone de sortie du Golgi (le trans-Golgi) On a pas de fusion des bicouches lipidiques via une fusion des membranes. On va avoir des transferts, notamment de lipides. Les transferts peuvent se faire du réticulum endoplasmique vers appareil de Golgi, ou le contraire, les deux sens de transfert sont possibles. Pour assurer le transfert, on a besoin de protéines spécifiques que l’on appelle les protéines de transfert, qui vont reconnaitre des éléments dans chaque membrane des organites: ● Côté Golgi: elles sont capable de venir centrer sur le PhosphatidylInositol 4Phosphate (PI4P) et vont venir centre sur la membrane du Golgi ● Côté du réticulum endoplasmique : c’est une protéine qui intervient. Par l’intermédiaire de cette double reconnaissance, on a un point de fixation entre les deux organites dans cette zone de contact. Quand la protéine est fixée dans le membrane des deux organites, elles peut assurer un transfert. On imagine un système dans lequel on a comme une pince qui prélève du céramide pour l’insérer dans le membrane du Golgi. Le céramide servira à la synthèse des shingoglycolipides. Pour le transport du cholestérol, une protéine similaire est entré par un PI4P du coté Golgi, et qui assure de la même façon un transfert du cholestérol. Et cette protéine est également capable de transférer le PI4P dans les deux sens. IV – Fonctions de l’appareil de Golgi 1 – Maturation des protéines issues du RE Cette maturation est séquentielle car les enzymes sont localisées dans différents compartiments selon le pH. L’action se déroule alors dans le compartiment où se trouve l’enzyme concernée (de la face cis vers la face trans). Les modifications sont notamment des glycosylations : GlcNAc, Gal, Ac sialique (NANA), Fucose, des phosphorylations, hydrolyse des mannoses et des sulfatations (confère charges négatives). On ne parle néanmoins pas de ségrégation stricte car certaines enzymes peuvent être retrouvées dans les deux compartiments. La séquence sera définie par la localisation des enzymes.

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a – Glycosylation α – Modification des oligosaccharides N-liés L’oligosacharide N-lié, comportant initialement 14 résidus, est lié à une asparagine. Il a déjà été en partie remanié dans le RE (élimination de 3 glucoses par la glucosidase). Il conserve donc 9 mannoses et 2 GlcNAc quand il arrive au Golgi. Il y a des hydrolyses de mannoses, ainsi que des glycosilations -

Poursuite de l’élagage +/- addition de nouveaux résidus sucrés

Dans le Golgi, il y a poursuite de l’élagage, mais aussi addition de nouveaux sucres. Ces sucres sont (comme dans le RE) activés par des nucléotides : on a donc des nucléotides-glucides. Ils entrent dans la lumière golgienne grâce à une perméase : il n’y a donc pas de flip comme c’est le cas dans le RE. Les enzymes du Golgi sont actives à des pH différents. Les modifications de l’oligosaccharide sont effectuées de façon séquentielle dans les différents compartiments du Golgi : elles ont lieu en fonction de la localisation de ces enzymes.

Selon le type de N-glycoprotéine, on distingue 2 mécanismes : → Simple élagage de mannoses L’élagage se limite à l’hydrolyse de 3 mannoses par la mannosidase I. On conserve alors une protéine riche en mannose, qui conserve donc 6 mannoses (et 2 GlcNAc).

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→ Remaniements complexes Elles subissent un élagage de 6 mannoses. Cet élagage retient donc seulement 3 mannoses, associés à 2 N-acétylglucosamines. Il reste donc une structure à 5 résidus sucrés, cela forme le cœur glycosylé.

Toutes ces protéines conservent ce motif (le cœur glycosylé) : c’est leur motif commun/de base. À partir de là sont greffés séquentiellement de nouveaux sucres par des glycosyl-transférase : Nacétylglucosamine ( GlcNAc), un galactose ( Gal), puis un acide sialique ( NANA), ce dernier portant une charge négative importantes à la surface des Cellules pour la répulsion et la protection de la membrane plasmique. -

Phosphorylation des résidus mannose

Cette phosphorylation concerne des protéines riches en mannoses : des hydrolases des lysosomes. Elle est importante car elle joue un rôle dans une des fonctions du Golgi qui est l’adressage des protéines.

Elle fait intervenir 2 enzymes : une GlcNAc phosphotransférase et une phosphoglycosidase. → La première étape, au niveau du CGN, implique une N-acétylglucosamine phosphotransférase. Les protéines concernées par cette phosphorylation possèdent une région de reconnaissance, sur laquelle se fixe l’enzyme. Cette région signal, appelée patch signal, est constituée d’ AA non consécutifs : le repliement de la protéine permet cependant le rapprochement de ces AA. Ce motif particulier est ainsi reconnu par l’enzyme et la protéine subit le transfert d’un GlcNAc-phosphate sur le groupement 6’-OH d’un résidu mannose.

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→ La protéine avance dans le Golgi, puis, au niveau du trans Golgi, il y a intervention d’une deuxième enzyme : la phosphoglycosidase, qui va cliver la N-acétylglucosamine. On va alors avoir exposition du mannose-6-phosphate, qui est un signal reconnu au niveau du réseau trans golgien, permettant l’exportation de la protéine vers les lysosomes. β – La O-glycosylation Au contraire de la N-glycosylation, qui se déroule dans le RE puis dans le Golgi, la O-glycosylation se déroule uniquement dans le Golgi. Elle est catalysée par des O-glycosyl-transférases transmembranaires avec un site actif côté luminal , l’action se déroule donc dans la lumière du Golgi. Les sucres activés par des nucléotides rentrent dans le Golgi par des perméases, puis il y a intervention d’une nucléoside diphosphatase, qui est un marqueur du trans Golgi . Ils sont alors ajoutés sur le groupement OH, le plus souvent d’une sérine ou d’une thréonine. Exemple de protéines O-glycosylées : ●

Les mucines, glycoprotéines retrouvées dans le mucus, sont fortement O-glycosylées.

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Les protéoglycanes sont des protéines très fortement O-glycosylées. Les glucides représentent jusqu’à 95 % de leur poids moléculaire. On y trouve au moins un motif glycosaminoglycane (entre les crochets), sous la forme d’une chaîne linéaire d’unités disaccharidiques qui sont répétées et qui va se fixer sur le OH d’une sérine. Les protéoglycanes subissent une sulfatation importante ce qui leur confère une charge négative. Cette dernière leur permet un rôle dans des répulsions électrostatiques, ce qui permet d’éviter l’agrégation des glycoprotéines. On les retrouve parmi les protéines sécrétées de la MEC (notamment dans le mucus), ou parmi les protéines liées à l’hémicouche exoplasmique de la membrane plasmique, où ils auront un rôle de protection de la membrane plasmique.

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