1. Cycle cellulaire - Notes de cours 1 PDF

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Cycle cellulaire...

Description

Le cycle cellulaire

Introduction : Histoire - 1665 → Robert Hooke invente le premier microscope (c’est le premier a observer des tissus vivants) et introduit la notion de ‘’cellule’’ (en référence aux cellules de monastère). observent l’ensemble des tissus vivants de plantes, ils déduisent que : «!Les plantes sont composées d’agrégations cellulaires!». 1838 → Schleiden et Schwann proposent la théorie cellulaire et le cytoblastème : «! Tous les organismes vivants sont composés de cellules! », et c’est dans le cytoblastème que se produisent la reproduction cellulaire et la division cellulaire. 1858 → Virchow écrit Omnis cellula e cellula : «! Tous les organismes apparaissent comme la somme d’unités vitales, chacune d’entre elles possédant les caractéristiques de la vie!» ; «!Tous les organismes sont produits par des cycles répétés de croissance et division cellulaire! ». Ces mécanismes sont intrinsèques à chaque cellule. 1980-1990 → Début de la biologie moderne, qui aboutit au prix Nobel en 2001 pour Hartwell, Nurse et Hunt qui sont à l’origine de la découverte des mécanismes de fonctionnement du cycle cellulaire.

- 1675 → N. Grew et M. Malpighi -

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La division cellulaire se déroule tout au long de la vie de l’organisme, ce qui permet le renouvellement permanent des cellules qui meurent. Le concept du cycle cellulaire : - Un mécanisme de reproduction. - Une séquence ordonnée d’évènements : la duplication du contenu de la cellule puis la division cellulaire à proprement parler, qui aboutit à deux cellules filles. Les caractéristiques universelles du cycle cellulaire : - L’information génétique doit être dupliquée (réplication de l’ADN : modèle de la double hélice de Watson et Crick, 1953 et démontré par Meselson et Stahl 1958). - Originaux et copies doivent être séparés (ségrégation des chromosomes, modèle proposé originalement en 1902 par Walter Sutton et Théodore Boveri). - Une cellule est divisée en deux cellules filles (cytocinèse : facilement observable au microscope même si l’on ne connaît pas encore très bien les détails). La division cellulaire est un mécanisme universel, mais on observe néanmoins des différences entre eucaryotes et procaryotes : Procaryotes

Eucaryotes

Une seule origine de réplication

Plusieurs origines de réplication

Chaque copie d’ADN s’attache à la membrane et se sépare graduellement à mesure des divisions

Génome plus grand qui nécessite un système pour répartir l’information génétique

Pas de condensation de l’ADN

Condensation et décondensation de l’ADN

Pas de structures spécifiques pour la ségrégation des chromosomes

Structures spécialisées pour la ségrégation chromosomique (fuseau mitotique)

Fission cellulaire au niveau du site de liaison ADN/ membrane

La fission cellulaire est perpendiculaire au fuseau mitotique

I.

Les différentes phases du cycle 1. Les événements essentiels du cycle cellulaire

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Phase G1 : située entre M et S. Phase S : phase de synthèse (réplication de l’ADN et duplication du centrosome) → 8h. Phase G2 : située entre S et M. Phase M : → 1h. • Désorganisation de l’enveloppe nucléaire et compaction des chromosomes : début de la phase M. • Alignement des chromosomes dupliqués à la métaphase, séparation des chromatides (pour obtenir deux lots de chromatides identiques) : anaphase. • Cytodiérèse (division cytoplasmique): fin de la mitose.

• L’interphase est le moment du cycle entre deux mitoses (phase M), correspondant aux phases •

G1+S+G2 → 23-24h. Les phases G1 et G2 sont des phases de croissance cellulaire à temps variable pendant lesquelles la cellule doit s’assurer que toutes les conditions internes et externes sont adéquates pour la synthèse de l’ADN et la mitose.

Pendant les phase S et M se déroule la transmission de l’information génétique, correspondant au processus automatique de réplication et de mitose.

2. Les facteurs de déclenchement des phases du cycle Ce sont les complexes kinase-cycline. Ils permettent le déclenchement des phases du cycle et s’assurent qu’il n’existe qu’une seule phase S par cycle. Ils agissent au niveau de quatre évènements : - La réplication de l’ADN en phase S et le blocage de la re-réplication. - L’entrée en phase M. - La séparation des chromatides. - La sortie de la mitose. Les principaux acteurs du cycle sont donc : - Les complexes kinase de la phase S (S-Cdk). - Les complexes kinase de la phase M (M-Cdk). - L’Anaphase Promoting Complexe (APC) : complexe ayant une activité ubiquitine ligase conduisant à la destruction protéolytique du substrat par le protéasome.

3. La phase G1 C’est une phase de synthèse d’ARNm, d’ARNt et de protéines à durée variable. Dans la phase G1, il existe ce que l’on appelle le point de restriction, qui est un point de non-retour, c’est à dire qu’à partir du moment où la cellule a passé cette étape, elle s’engage dans le cycle cellulaire. Sauf problème majeur déclenchant le mécanisme de surveillance, la cellule va jusqu’à la phase M. Quand la cellule ne passe pas le point de restriction, elle est dans une phase dite de quiescence cellulaire G0. La plupart des cellules d’un organisme eucaryote sont des cellules qui ne cyclent pas, ce sont des cellules dites quiescentes. Ce point de restriction a été mis en évidence par les expériences de Arthur Pardee en 1974. Il a montré qu’il existait en G1 un point de restriction permettant de contrôler la prolifération cellulaire. L’expérience a consisté à arrêter la croissance cellulaire par différentes méthodes pour ensuite organiser la reprise du cycle cellulaire. Il remarque alors qu’il faut toujours le même temps pour arriver à la phase S. Il en déduit qu’il existe un point dans le cycle cellulaire où les cellules peuvent s’arrêter et rester en quiescence. Il appelle ce point le point de restriction. Une fois le point de restriction passé, la cellule se lance dans un nouveau cycle de manière irréversible. Si il n’y a pas d’alerte au niveau de la surveillance, la cellule va passer en phase S. Si la cellule présente une anomalie, les mécanismes de surveillance ou ‘’checkpoints’' se mettent en place.

4. La phase S C’est une phase de synthèse d’ADN, et donc de réplication. C’est au cours de cette phase que le matériel génétique double. Ainsi, si on connait la teneur en ADN de la cellule, on peut déterminer en quelle phase du cycle elle se trouve. De plus, il existe au cours de la phase S un certain nombre de facteurs qui permettent de la promouvoir, ce qui a été montré par des expériences de fusions cellulaires. La fusion cellulaire consiste à fusionner des cellules qui se trouvent à différentes phases du cycle. En fusionnant, les cellules mettent en commun leur cytoplasme (pas leur noyau), et on obtient alors des hétérocaryons. On peut fusionner les cellules par des produits chimiques ou des virus. - Quand on fusionne une cellule en phase S avec une cellule en G1, le noyau en G1 passe en S, ce qui signifie qu’il existe un facteur capable d’initier la synthèse de l’ADN et d’enclencher la phase S. - Quand on fusionne une cellule en phase S avec une cellule en G2, le noyau en G2 reste en G2 et continue son cycle cellulaire. Mais il n’y a pas de synthèse d’ADN, ce qui montre que le noyau en G2 n’est pas compétent pour dupliquer sont ADN, et donc il existe quelque chose qui empêche la re-réplication de l’ADN. - Quand on fusionne une cellule en phase G1 avec une cellule en G2, on obtient pas de synthèse de l’ADN. Il existe donc un facteur qui est capable d’initier la synthèse de l’ADN, qui a été appelé le SPF, et qui n’est actif que dans les cellules en phase S et G1. L’initiation de la réplication se fait par les origines de réplication. Chez les eucaryotes, il y a plusieurs origines de réplication et leur nombre est variable selon les organismes. Une unité de réplication correspond à un groupe de réplicons qui vont tous commencer la réplication au même moment. L’unité de réplication correspond alors à l’ADN synthétisé à un moment donné de la phase S (environ 1000 sites de réplication actifs à un moment donné).

Cette initiation se déroule aussi en G1 par la constitution du ‘‘pré-réplicative complexe’’ (pré-RC), dont les principaux acteurs sont : - Le cdc6 (Cell Division Cycle 6). - Le cdt1. - L’ORC (Origin Replication Complex). - Le MCM (Mini-Chromosome Maintenance). Le cdc6 est une protéine qui se fixe sur l’ORC (l’active) et est nécéssaire à la liaison avec les protéines MCM qui sont localisées au niveau des origines de réplication. Le cdt1 va venir s’associer au niveau des ORC et des MCM pour permettre la mise en place des molécules spécifiques de la réplication. Une fois toutes ces protéines associées, on obtient le pré-réplicative complexe. Les protéines MCM interagissent alors avec les protéines MCM10, ce qui permet au complexe MCM de bien se positionner. A ce moment, tous les éléments sont réunis pour que la réplication puisse commencer.

Le déclenchement de la réplication se fait par l’intervention des facteurs de la phase S (complexes kinases), qui vont permettre la phosphorylation de cdc6. Cdc6 peut alors se dégager de l’origine de réplication. De même, cdt1 est phosphorylé et dégradé par le CSF, et donc le complexe réplicatif peut alors être mis en place et permet la synthèse d’ADN à partir de l’ORC. Représentation de la fourche de réplication :

La réplication se fait par la mise en place de la polymérase qui permet la synthèse des nouveaux brins d’ADN. Les hélicases et les topoisomérases interviennent sur la structure de l’ADN en décondensant l’ADN. Au cours de la phase S se déroulent deux actions contraires : - Le déclenchement de la réplication. - Le bloquage de la re-réplication.

❖ Le déclenchement de la réplication : Après la mise en place du pré-RC, ce sont les CDK qui vont phosphoryler un certain nombre de facteurs ce qui permet de libérer l’origine de réplication et permet aux enzymes de réplication de se mettre en place. Tout cela ce fait donc grâce aux kinases de la phase S. Pour qu’il y ai déclenchement de la réplication, il faut que cdc45 soit recruté, car il permet le recrutement de l’ADN polymérase, des primases et RPA. Le réplication peut alors débuter. ❖ Le bloquage de la re-réplication Tout d’abord, cdc6 se dissocie de l’ORC et donc, à partir de ce moment là, il n’y a plus de possibilité de remettre en place un complexe de pré-initiation de la réplication. La phosphorylation de cdc6 se fait par les kinases de la phase S (S-CDK), par ubiquitinylation par le complexe SCF, qui aboutit à la dégradation de cdc6 dans un protéasome. De plus, les protéines MCM sont phosphorylées et, à ce moment là, sont exportées hors du noyau. La Géminine séquestre cdt1 et donc empêche également la formation du complexe de préréplication fonctionnel. Le cdt1 peut être phosphorylé et dégradé par le complexe SCF. La concentration en Géminine augmente en phase S, donc de plus en plus de cdt1 est séquestré au fur et à mesure de la progression de la phase S, et ce jusqu’à la phase M. Cdc6 et cdt1 sont des facteurs majeurs pour bloquer la re-réplication de l’ADN, et c’est la phosphorylation de ces facteurs par les kinases de S qui permettent ce bloquage.

5. La phase G2 C’est une étape courte, parfois inexistante qui correspond à un contenu en ADN de 4n. Cette phase prépare à la mitose, contrôle la structure de l’ADN et ainsi permet de voir si l’ADN est apte à débuter une phase S.

6. La phase M C’est un mécanisme universel qui assure à chaque cellule de posséder un lot de chromosome identique et un centrosome. Il doit également y avoir une division équitable du matériel cytoplasmique au cours de la cytodiérèse. La phase M correspond donc à une mitose et une cytodiérèse. Il s’y déroule principalement une ségrégation des chromosomes et une réorganisation considérable du noyau et du cytoplasme. Les acteurs principaux de cette phase S sont : - Les chromosomes (l’ADN). - Les centrosomes. A partir de l’observation de la structure des chromosomes, on a pu définir un certain nombre d’étapes de la division nucléaire : - La prophase. - La pro-métaphase. - La métaphase. - L’anaphase. - La télophase. Les phases correspondant aux critères moléculaires de la mitose ne coïncident pas toujours exactement avec les différentes phases cytologiques de la mitose. Ils correspondent à l’activation d’un certain nombre de facteurs (complexes cyclines/CDK).

❖ La prophase : Elle correspond à l’activation de la CDK/cycline A. Il s’y déroule une condensation des chromosomes et une réorganisation du cytosquelette. La mise en place du fuseau se fait en fin de prophase et la séparation des chromatides dépend de ce fuseau, puisque les chromosomes sont reliés au fuseau mitotique. La mise en place de ce fuseau doit forcement être bipolaire. ❖ La prométaphase : Elle correspond au désassemblage de l’enveloppe nucléaire, à l’interaction des microtubules avec les chromosomes pour permettre le positionnement de ces chromosomes, et à l’alignement des chromosomes sur la plaque équatoriale, qui est positionnée entre les deux fuseaux. Ces étapes sont déterminées par l’attachement des microtubules sur le chromosome, au niveau de ce que l’on appelle les kinétochores. Le kinétochore est une zone du chromosome où les microtubules vont pouvoir s’attacher et permettre le positionnement des chromosomes au niveau de la plaque équatoriale. Ils ont une structure dite trilamellaire, composée d’une plaque externe permettant la fixation des microtubules, et une plaque interne permettant la stabilité et l’assemblage du kinétochore. En regardant en microscopie électronique, on observe une couronne au niveau de ce kinétochore, du côté de la plaque externe. Cette couronne correspond à la présence de moteurs moléculaires. Lorsque les microtubules sont attachés, il y un donc un réseau de tension équivalent sur les deux chromatides, ce qui permet au chromosome de se positionner au milieu de la cellule. Chez les eucaryotes supérieurs, plusieurs dizaines de microtubules sont reliés au kinétochores, alors que chez les procaryotes simples, il peut n’y avoir qu’un seul microtubule par kinétochore.

❖ La métaphase : Tous les chromosomes sont alignés sur la plaque métaphasique. C’est une étape déterminante car il faut que tous les chromosomes soient parfaitement alignés, ce qui est vérifié par un nouveau point de contrôle. Si un des chromosomes n’a pas été capturé par les microtubules, alors la cellule ne peut pas entrer en anaphase. La séparation des deux chromatides est liée à un certains nombre de facteurs qui sont présents au niveau des kinétochores. Ces facteurs sont BubR1, Mad1 et Mad2 (mitosis arrest deficient). BubR1 est situé au niveau du kinétochore et permet de voir si les protéines de tension telle que CENP-E sont tendues, ce qui prouve que les microtubules sont bien attachées. - Tant que rien n’est attaché, les protéines Mad sont activées, et Mad2 inhibe le fonctionnement de APC (Anaphase Promoting Complex). - Quand les chromosomes sont attachés correctement, les protéines de tension arrêtent d’activer Mad2, ainsi Mad2 se peut plus se lier au kinétochore, et alors l’APC peut jouer son activité ubiquitine ligase pour permettre l’anaphase.

❖ L’anaphase : Elle correspond à la migration des chromosomes vers les pôles de la cellule. Pendant la phase S, il y a mise en place des complexes cohésine entre les deux chromatides. Ils permettent le maintien des deux chromatides accolées. Le déclenchement de l’anaphase est permis par la dégradation des cohésines par la Séparase. La Séparase est inactivée par un autre facteur appelé la Sécurine. Tant que l’APC n’est pas activé, la Sécurine empêche la Séparase de fonctionner. Lorsque l’APC est activé, il ubiquitine la Sécurine, qui est dirigée vers le protéasome et est dégradée. À partir de ce moment, la Séparase peut aller cliver les complexes cohésine, et donc les chromatides soeurs peuvent se séparer. Le complexe APC est activée par le facteur cdc20. Les cohésines sont des complexes multimères Scc1, Scc2 et Scc3. Ces complexes sont mis en place pendant la phase G1 et la phase S. Les boucles de cohésine se mettent en place jusqu’à la mitose. Lors de la mitose, ils sont désacétylés pour permettre la séparation des chromosomes.

Les mutations de Scc1 et Scc3 peuvent entrainer des pathologies congénitales rares, telles que le syndrome de Cornelia de Lange. ❖ La télophase : Elle correspond au réassemblage de l’enveloppe nucléaire, à la décondensation des chromosomes et à la formation du nucléole. ❖ La cytokinèse : Elle est différente entre les cellules animales et les cellules végétales. - Dans les cellules animales, elle passe par la mise en place d’un anneau d’actine-myosine, qui se resserre au niveau de la plaque équatoriale. En fin de cytokinèse, on voit une séparation physique des deux cellules, avec en général l’existence de corps intermédiaires entre les deux cellules. Ce sont des fragments de microtubules qui se retrouvent piégés, et qui restent donc présent après la mitose. - Dans les cellules végétales, il y a mise en place d’un phragmoplaste, qui est un réseau de microtubules courts se positionnant au niveau de la plaque équatoriale, et qui permet donc le positionnement des vésicules de Golgi (qui contiennent les précurseurs de la paroi). Quand ces vésicules vont fusionner, elles vont permettre la formation des membranes cellulaires et de la paroi.

7. Méthodes d’études du cycle cellulaire Quand on regarde la teneur en ADN d’une cellule au cours du cycle cellulaire, on est capable de déterminer la phase du cycle où elle se trouve.

❖ Les cultures cellulaires : Elles permettent d’observer des cellules en phase S. On peut regarder si elles incorporent le BrdU (un analogue de la thymidine) et, grâce à un anticorps anti-BrdU couplé à la péroxydase, on peut repérer les cellules qui sont en phase S. Le PCMA peut aussi être utilisé. On s’aperçoit que 30 à 50% des cellules sont en phase S, et comme la prolifération cellulaire n’est pas synchronisée, on peut en déduire que la phase S occupe 30 à 50% du cycle cellulaire. ❖ La cytomètrie en flux : On l’appelle encore FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter). C’est un trieur de cellules qui les sépare en fonction de l’activation de fluorescence. La stratégie de la cytomètrie en flux est de marquer l’ADN en fluorescence. Le taux de fluorescence est donc proportionnel à la quantité d’ADN présent dans la cellule. Grâce a cette méthode, on peut déduire la proportion de cellules à chaque phase et, en connaissant le temps total de la mitose, on peut en déduire la durée des différentes phases.

❖ L’incorporation de marqueurs spécifiques : On regarde au cours du temps les cellules qui sont marquées et en mitose. Si on prend une population de cellules non synchronisées, et qu’on fait un marquage sur un temps court (incorporé dans l’ADN), on marque alors les cellules qui sont en phase S (début et fin). On regarde alors régulièrement l’évolution du nombre de cellules en mitose qui sont marquées. Cela permet de déterminer les durées des phases du cycle. On peut ensuite tracer le graphique : % de cellules en mitoses marquées en fonction du temps, pour déterminer les durées.

❖ La synchronisation des cellules en culture : Pour cela, on peut jouer sur les conditions de culture. - On peut enlever le SVF du milieu de culture, afin de les faire entrer en phase G0, puis le remettre pour les faire démarrer le cycle au même moment. - On peut utiliser des drogues pour bloquer les cellules dans une phase du cycle (aphidicholine, nocodazole,…en phase S). - On peut utiliser le mitotic shake off, qui utilise les différences d’adhésion entre les cellules en interphase et les cellules en mitose. - On peut utiliser l’élutriation, qui consiste à séparer les cellules sur un gradient (de saccharose par exemple) et donc à les ranger en fonction de leur densité. Chaque densité correspond à une phase du cycle cellulaire.

II. Le contrôle du cycle cellulaire Les événements du cycle cellulaire sont extrêmement contrôlés.

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Le cycle cellulaire...