Le contrôle du cycle cellulaire - cours PDF

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chapitre 8...

Description

Le contrôle du cycle cellulaire Réseau complexe de protéines régulatrices constituant le système de contrôle du cycle cellulaire (commutateurs, freins) Tous les eucaryotes utilisent la même machinerie et les mêmes mécanismes de contrôle pour activer et réguler les évènements de leur cycle cellulaire Toutes les protéines intervenant dans la régulation du cycle cellulaires sont extrêmement bien conservées dans l’évolution, d’où des études sur modèles différents

Régulation très précise - Exemple : la taille des cellules est rigoureusement contrôlée (éviter que l’une des 2 cellules filles soit plus petite)

2 fonctions essentielles :  Le maintien de l’ordre rigoureux des phases et le contrôle précis des

phases de transition (G1/S et G2/M) qui dépend principalement des protéines CDK et des cyclines - La surveillance de mécanismes fondamentaux qui conditionnent la vie cellulaire 

La qualité de l’ADN, le maintien du patrimoine génétique, de l’exactitude de la réplication de l’ADN et de la prolifération cellulaire



L’achèvement de la réplication, la position des chromosomes

 Cette surveillance est exécutée au niveau de points de contrôles

I.

Système de contrôle du cycle cellulaire

La régulation du cycle cellulaire dépend essentiellement de 2 familles de protéines : - Cdk : sérine-thréonine-kinase activées de façon cyclique lorsqu’elles sont liées à une cycline - Cyclines : protéines à concentration variable au cours du cycle cellulaire, ne possédant pas d’activité enzymatique et se liant aux Cdk pour en réguler l’activité

1)Les cyclines : - Toutes les cellules eucaryotes ont besoin de 3 classes de cyclines :  Cyclines G1/S : activent les Cdk dans la phase G1 tardive et contribuent

à déclencher la progression à partir du point de départ  Cycline S : lient les Cdk tout de suite après le point de départ et aident à

stimuler la duplication des chromosomes  Cyclines M : activent les Cdk qui stimulent l’entrée en mitose au point

de contrôle G2/M  4ème classe de cyclines : les cyclines G1 : aident au contrôle de l’activité

des cyclines G1/S Complexes cyclineCdk G1-Cdk G1/S-Cdk S-Cdk M-Cdk

Cycline

Partenaire CDK

Cycline D Cycline E Cycline A Cycline B

Cdk4, Cdk6 Cdk2 Cdk2, Cdk1 Cdk1

- La montée et la chute des taux de cyclines déterminent l’activité Cdk au cours du cycle cellulaire  L’augmentation de la concentration en cycline permet la formation du

complexe cycline-Cdk actif qui entraine l’entrée en phase M

- Des Cdk différentes s’associent à des cyclines différentes pour déclencher les différentes étapes du cycle cellulaire

2)Les Cdk Rôle des Cdk :  Rôle dans la progression de

la

cellule au cours du cycle (passage d’une phase à une autre)  Rôle dans certains évènements du cycle (compactage des chromosomes,

fragmentation de l’enveloppe nucléaire...)

Fonctionnement des Cdk - Le fonctionnement des Cdk est régulé par 3 phénomènes :  La liaison à une cycline possédant elle-même un cycle de synthèse /

dégradation

 La phosphorylation ou déphosphorylation par des protéines : kinase

CAK (Cdk activatrice), kinase Wee1 (inhibitrice) et phosphatase CDC25 (activatrice)

Pour être actif, un Cdk doit être phosphorylé sur 1 site et déphosphorylé sur 2 sites

 La liaison de protéines inhibitrices CKI de Cdk

- Formation séquentielle de complexes Cdk/ cyclines

- Expression séquentielle des cyclines - Une même cycline peut interagir avec différentes Cdk - Une même Cdk peut être activée par différentes cyclines - Cyclines fréquemment surexprimées dans le cancer

- Phosphorylation ou déphosphorylation des Cdk par des protéines  Kinase CAK : phosphorylation activatrices (T 161 : Thréonine en position 161)  Kinase Wee 1 : inhibitrices (Y 15 : Tyrosine en position 15)  Phosphatases Cdc 25 : déphosphorylation activatrices (T14-Y15) - Triple phosphorylation : complexe cycline-Cdk inactive - Déphosphorylation de T14 et Y15 : complexe cycline-Cdk actif

Inhibition des complexes Cdk : cycline par les CKI  Famille p16 (p16, p15, p18, p19) : compétition avec les cyclines pour

leur liaison aux Cdk  Famille p21 (p21, p27, p57) : inactivent toutes les Cdk impliquées dans

la progression du cycle cellulaire

Mutation inactivatrice des CKI : cancer

- Exemple : mutation de p16 → mélanomes malins

Points de contrôle du cycle cellulaire : des CKI peuvent arrêter le cycle au niveau de points de contrôle spécifiques

Les différents systèmes de régulation des complexes Cdk-cyclines

Activation des Cdk - cycline - phosphorylation par CAK (Cdk activating kinase) - Déphosphorylation par des cdc-25 (phosphatases) Inhibition des Cdk

- Phosphorylation par Wee-1 (kinases inhibitrices) - Interaction avec les CKI (cyclin dependent kinase inhibiteur)

Le système de contrôle du cycle cellulaire - Le système de contrôle du cycle cellulaire dépend aussi d’une protéolyse cyclique o Exemple : initialisation de la séparation des deux chromatides sœurs par le complexe APC/C = complexe de promotion de l’anaphase

II. Les différents points de contrôle : Des protéines qui inhibent les Cdk peuvent arrêter le cycle au niveau de points de contrôle spécifiques Les points de contrôle contrôlent chacun une phase de transition : G1/S, G2/M, point de restriction

1. Phase G1 et régulation du cycle cellulaire La phase G1 est une phase de synthèse, au cours de laquelle la réplication de l’ADN ne se produit pas.

Définition : ensemble de mécanismes contrôle la cellule et l’oriente soit vers un nouveau cycle, soit vers l’arrêt du cycle en entrant en phase G0  Rôle essentiel dans la régulation du cycle cellulaire 2 points de contrôle : - Le point de restriction - Le point de contrôle tardif G1/S

La cellule contrôle son environnement, l’état des chromosomes et sa propre taille qui double avant la phase S : - Environnement : détection de nutriments disponibles ou de signaux de prolifération (signaux mitogènes) provenant d’autres cellules ou de la matrice extracellulaire - Etat des chromosomes : vérification de l’absence de lésion laissée par le cycle cellulaire précédent - Taille : expérience de microchirurgie chez l’amibe.

 Régulation de la prolifération cellulaire par le point de restriction Au point de restriction, les cellules évaluent les stimuli externes et internes et décident, ou non, de s’engager dans un autre tour de réplication de l’ADN et de division. Avant le point de restriction : la cellule poursuit son cycle uniquement si elle reçoit des signaux extracellulaires qui lui sont favorables. Lorsque la cellule passe le point de non-retour : quoi qu’il arrive la cellule est engagée dans le cycle Définition : point à partir duquel le cycle cellulaire continue, même si les facteurs mitogènes sont éliminés. Il régule l’expression des gènes nécessaires à la progression cellulaire.

 G0 et contrôle de la croissance Définition : phase de « quiescence mitotique » ou de « repos mitotique » dans laquelle les cellules filles peuvent entrer dès la fin de la mitose.

 Etat G01 : cellules ayant quitté le cycle en G1, sont bloquées en un état

quiescent mais elles ont le potentiel de repasser en cycle (phase S) dans certaines conditions.

 Etat G0D (D = différenciées ou fonctionnelles) : cellules ayant quitté le

cycle en G1 et ayant perdu la capacité de se diviser par suite d’une spécialisation très poussée.

 Mécanismes moléculaires de la phase G1 1/ Activation des gènes codant pour les cycles de la phase S (cyclines E et A) - Rôle du complexe cycline D/Cdk4 dans la progression de la cellule pendant la phase G1 - Rôle de la protéine Rb ou protéine de sensibilité au rétinoblastome  Phosphoprotéine de 105 kDa  Si absence ou mutation du gène codant Rb, rétinoblastome chez l’enfant - Rôle du facteur de transcription essentiel E2F

 Facteur de transcription du gène de la cycline E

Phosphorylation activatrice du complexe cycline D/Cdk4 par CAK. La libère E2F qui pour les en particulier

phosphorylation de Rb active les gènes codant protéines de la phase S et la cycline E .

2/ Passage

du point de restriction

La cellule franchit le point de restriction au moment où la quantité de cycline D est suffisante

Le complexe cycline E/Cdk2, comme le complexe cycline D/Cdk4, phosphoryle Rb. Cette nouvelle phosphorylation ajoutée à la précédente produit une protéine Rb phosphorylée. La transcription de la cycline A est à son tour stimulée.

 Propriétés des cellules en G0 Absence de cycline : le facteur E2F qui active l’expression des gènes codant pour des cyclines est maintenu inactif par p Rb. Les cellules assurent les fonctions imposées par leur différenciation

Des facteurs de croissance, mitogènes ou autres stimuli d’origine extracellulaire peuvent déclencher le retour du cycle cellulaire. Les facteurs de croissance - La multiplication cellulaire peut être déclenchée par de très nombreuses molécules, comme les facteurs de croissance  EGF : facteurs de croissance de cellules épithéliales. Il se fixe sur un récepteur membranaire EGF-R  PDGF : facteurs de croissance de l’endothélium vasculaire, d’origine plaquettaire. C’est une substance mitogène des cellules endothéliales. Il agit aussi sur la multiplication des fibroblastes et des fibres musculaires  NGF : facteur de croissance nerveux. Il contrôle la croissance des neurones  FGF : rôle dans la croissance des fibroblastes et des cellules endothéliales et des myoblastes

 Retour d’une cellule en G0 dans le cycle cellulaire

- Activation de la GTPase Ras

- Activation du gène myc (puissant promoteur de la prolifération cellulaire) - myc se fixe sur le promoteur du gène de la cycline D et déclenche sa transcription - La phosphorylation de Rb par les complexes cycline D/Cdk4 libère E2F - Elévation rapide de l’expression et de l’activité d’E2F et de cycline E/Cdk2 - Les cellules regagnent le cycle avant le point de restriction

 Point de restriction et cancer

De nombreux types de cancer sont dus à une mauvaise régulation de la croissance cellulaire lors des phases G1 et G2. Le dysfonctionnement du point de restriction est un facteur fréquent de la transformation : - Mutation d’un ou plusieurs composants du système p16cyclineD/Cdk4/Rb dans la plupart des cancers humains - Plusieurs virus provoquant le cancer (virus simien 40 ou SV40 et adénovirus) fabriquent des protéines qui facilitent la transition G1 → S en liant p Rb et en libérant E2F Rb-E2F : action antiproliférative  protéines active (elle exerce son activité normale antiproliférative) Si pas de liaison : inhibition de l’activité antiproliférative  prolifération : protéines inactive Si Rb muté : inactive  prolifération (elle n’exerce pas son activité normale antiproliférative)

2. Point de contrôle G1/S = la cellule analyse l’ADN avant le début de la réplication Surveillance de l’intégrité de l’ADN cellulaire par un point de contrôle tardif en G1 :  Kinase ATM  Kinase Cdk2 ou protéines kinase du point de contrôle  Cdc25 : phosphatases responsables de la déphosphorylation de Cdk1, 2,

4 et 6  p53 :

 Régulateur de la prolifération de la plupart de types cellulaires  Facteurs de transcription de l’ADN qui active des gènes impliqués dans le déclenchement de l’apoptose ou dans l’arrêt du cycle cellulaire  Accumulation si altération de l’ADN  Mutation du gène codant pour p53 prédisposent aux cancers (poumons et seins)  Son inhibition provoque une prolifération cellulaire Contrôle de la qualité de l’ADN S’il existe des anomalies, mêmes légères, de l’ADN, il y a : o Inactivation de Cdc25A qui ne peut plus activer les complexes cycline A/Cdk1 et cycline E/Cdk2 o Synthèse et accumulation de p53 Il existe des contrôles de l’ADN tout au long du cycle

Le sv o i e sd er é g ul a t i ona c t i v é e spa run ea l t é r a t i ondel ’ ADN.

3. Phase S et réplication de l’ADN La quantité d’ADN double au cours de cette phase : la cellule devient une cellule tétraploïde

Il n’y a pas de point précis pour la surveillance de l’exécution : elle s’effectue pendant les phases S et G2. SI une anomalie est détectée, le cycle est interrompu et la transition G2/M n’est pas réalisée. Corrections sur épreuve des protéines synthétisées : elles se produisent pendant cette phase, en même temps que la réplication.

4. Point de contrôle G2/M La cellule contrôle le degré d’avancement de la réplication de l’ADN. Elle intervient pour bloquer l’activité des cyclines A/Cdk1 et B/Cdk1 si la réplication n’est pas terminée ou si l’ADN est endommagée (rupture de brins d’ADN) Point de contrôle en G2 ou point de contrôle de la structure de l’ADN Il fait intervenir 3 sortes de composants : des détecteurs, des kinases et des effecteurs - les détecteurs détectent des lésions de l’ADN, ils deviennent activés - Les détecteurs activent les protéines kinases spécialisées qui transmettent cette information à une série de molécules effectrices - Les effecteurs bloquent la progression dans le cycle cellulaire soi de façon directe soit indirecte

Point de contrôle en G2 et cancer

Les défauts du point de contrôle en G2 sont associés au cancer

Exemple : le lymphome de Burkitt : le gène codant c-myc (puissant promoteur de la prolifération cellulaire), localisé sur le chromosome 8, est inséré dans le groupe de gènes codant la chaine légère des immunoglobulines, sur le chromosome 14. Il y a synthèse de niveaux élevés d’immunoglobulines par les lymphocytes B et développement d’un lymphome = cancer des lymphocytes. - Translocation de c-myc du chromosome 8 vers le chromosome 14 ou se situent les gènes codants les chaines lourdes et Des Ac Expression anormale de c-myc

5. La transition métaphase-anaphase Entrée en mitose : rôle du MPF MPF : hétérodimères protéique - Kinase (p34) : Cdc 2 : Cdk1 - Protéines (p45) : cycline B MPF n’est fonctionnel que pendant la phase M

£

Protéines cibles du MPF actif et évènements de la mitose liés à l’activité : - Protéines cibles phosphorylées o

Condensine, Histones H1 et H3  condensation des chromosomes

o

Lamines  désorganisation de l’EN (dispersion lamines A et C)

o

APC : anaphase promoting complex  dégradation de la sécurine et de la cycline B par APC-Cdc 20

Le point de contrôle du cycle cellulaire - Point de contrôle métaphase-anaphase ou point de contrôle de l’assemblage du fuseau : o La cellule contrôle le bon positionnement des chromosomes sur la plaque équatoriale o Etape essentielle car il est indispensable que le chromosome soient correctement repartis entre les 2 cellules filles

Blocage de la cellule en métaphase Si les chromatides ne s’attachent pas par leur kinétochore aux microtubules, le passage de la cellule en métaphase est bloqué.

Rôle des protéines kinases BUB (Buddind Uninhibited by Benzimidazole ; bourgeonnement non inhibé par le benzimidazole) qui se lient à tous les kinétochores :

6. Fin de la division cellulaire Transition métaphase-anaphase et sortie de la mitose :  Destruction du MPF  Rôle important du complexe APC avec liaison à Cdc 20 ou Cdh 1 ¤ La protéolyse de la cycline B induit l’inactivation de Cdk1, ce qui met fin à la division cellulaire.

III. Les méthodes d’études du cycle cellulaire : Les étapes du cycle cellulaire sont très difficilement analysables chez l’animal au sein du tissu différencié L’analyse se fait essentiellement sur des cultures de cellules « in vitro » Méthodes basées sur la possibilité d’identifier les événements majeurs du cycle : la phase S et la phase M Il n’y a pas de méthodes directes pour établir si les cellules en G1 ou G2 sont à l’intérieur ou hors du cycle cellulaire Différentes méthodes : -

Incorporation de Thymidine marquée au 3H Incorporation de Bru PCNA Cytométrie en flux Mesure de l’indice ou index mitotique (en cancérologie)

1. Observation de cellules en phase S Utilisation d’un analogue radioactif ou fluorescent de la Thymidine (nucléoside) : - Incorporation dans l’ADN en cours de réplication

Pulse de thymidine traitée puis analyse par autoradiographie en microscope électronique Mesure de la radioactivité incorporée sur ADN précipitée Pulse de Bromo-desoxyuridine (BrdU) Révélation avec un anti-BrdU couplé à la péroxidase (A) ou à un fluorochrome (B)

La prolifération cellulaire n’est pas synchronisée La plupart des cellules en culture poussent relatives vite : 30 à 50% des cellules en phase S

1. Incorporation de BrdU et marquage PCNA in vivo : hépatocytes PCNA : marqueur endogène de prolifération qui augmente en phase G2/M et diminue en phase G0.

2. Cytométrie en flux Incubation de cellules perméabilisées avec de l’iodure de propidium (agent fluorescent et intercalent de l’ADN) Mesure de la fluorescence (marquage rouge) L’intensité de la fluorescence dépend de la quantité d’ADN

La plupart des cellules se trouvent en G1 parce que c’est l’étape la plus longue. En G1, les cellules sont diploïdes En phase S, l’ADN commence à se dupliquer : l’intensité de la fluorescence augmente

Elle atteindra le double de la valeur en G1 dans les cellules en G2 et M qui ont complétement dupliqué leur ADN (cellules tétraploïdes)

3. Mesure de l’indice ou index mitotique Une fraction de cellules au sein d’une tumeur est en phase de prolifération, déterminant la croissance de la tumeur. Une telle population est la cible de la chimiothérapie

La détermination de cette fraction proliférante peut se définir expérimentalement par la mesure de l’index de Thymidine tritiée, ce qui n’est pas applicable à la pratique clinique courante

La mesure au microscope de l’index mitotique = proportion de cellules en mitose : - éléments pris en compte dans le grade du cancer du sein par exemple - élément déterminant pour apprécier l’efficacité d’une chimiothérapie adjuvante (dans les cancers du sein et les sarcomes par exemple)...