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PRÁCTICA No. 23 Deshidrogenasa láctica o Lactato deshidrogenasa (LDH o DHL)

Integrantes del equipo: Gómez García Naomi Sofia, Meza Juárez Joseline Itzel, Munguía Flores Diego, Samaniego Palacios Diana Patricia.

Fecha de entrega: 23 de Octubre del 2020

Docente encargado: Javier Araiza

Objetivos: ● ● ●

Realizar las determinaciones de DHL en una muestra biológica. * Investigar el fundamento de determinación de DHL. Analizar la importancia de la determinación de DHL y las principales patologías relacionadas con sus alteraciones.

Introducción: Las enzimas generadas durante el metabolismo celular pueden modificar sus concentraciones frente a diversos fenómenos fisiopatológicos, permitiendo de esta manera que su cuantificación en suero permita orientar y precisar ciertos diagnósticos. Entre las enzimas más conocidas se encuentra la deshidrogenasa láctica (DHL) (EC 1.1.1.27). La deshidrogenasa láctica es una enzima implicada en la vía metabólica glucolítica, especialmente en condiciones anaerobias, encargada de la conversión de piruvato a lactato mediante la oxidación NADH a NAD+. Normalmente, hay cinco isoenzimas de la deshidrogenasa láctica presentes en células vivas y conformadas por la combinación entre polipéptidos-M y polipéptidos H. En términos estructurales, es un tetrámero compuesto por dos subunidades activas (H y M), existiendo así cinco isoformas: DHL1 (HHHH), DHL2 (HHHM) hasta DHL5 (MMMM). Está enzima se encuentra en el citosol de prácticamente todas las células humanas, por lo que todos los tejidos muestran cantidades similares de DHL, aunque es importante mencionar que varía el porcentaje de presencia de cada isoforma en funcion de su ubicación, DHL1 y DHL2 se expresan primordialmente en el miocardio y los eritrocitos, mientras que en el hígado y el músculo se expresan DHL4 y DHL5, esta última también es la que predomina en células neoplásicas (García A, Rosas D, Santoyo S, et al. 2018). Cuando existe alguna enfermedad, lesión o material tóxico que daña los tejidos, la DHL de las células se liberan al torrente sanguíneo, como consecuencia de la degradación de membranas celulares, provocado por el daño tisular que se esté cursando. Dado que la DHL es una enzima bastante estable, la DHL se ha utilizado ampliamente para evaluar la presencia de daño y toxicidad de tejidos y células. La determinación sérica de DHL se utiliza para valorar principalmente daño tisular en pruebas de funcionamiento hepático, casos de pancreatitis y estudio de síndrome coronario agudo, por mencionar algunos ejemplos. Por lo general, todos los laboratorios utilizan métodos colorimétricos (transformación de lactato a piruvato) para cuantificar DHL presente en la muestra, un reducido grupo de laboratorios usa la técnica inversa (piruvato a lactato); la realización de electroforesis para identificar con precisión la cantidad presente de cada isoforma de DHL, no se realiza de manera rutinaria y se reserva para estudios de investigación muy específicos (García A, Rosas D, Santoyo S, et al. 2018).

FUNDAMENTO DEL MÉTODO Producto: LDH-L Presentación: 120 mL: 1 x 100 mL A + 1 x 20 mL B Código: 1999726

Kit comercial LDH-L de Wiener-Lab, para la determinación de lactato deshidrogenasa en suero, plasma y líquido cefalorraquídeo. El método se basa en el siguiente esquema de reacción:

La actividad catalítica de DHL se determina a partir de la velocidad de formación de NADH, la cual es directamente proporcional, es decir, a mayor presencia de DHL, mayor es la actividad catalítica y de igual manera mayor es la concentración de NADH, esto se observa midiendo el aumento de la absorbancia a 340 nm. Las concentraciones del ensayo están optimizadas de acuerdo con los procedimientos de referencia para la medición de la actividad catalítica de las enzimas a 37° C, descritos por la Federación Internacional de Química Clínica (IFCC).

Reactivos provistos - Reactivo A: solución de metilglucamina (MEG) 400 mM y lactato 61 mM; pH 9,4 a 37°C. - Reactivo B: solución conteniendo NAD 61 mM. Reactivos Provistos: listos para usar. Reactivos no provistos - Calibrador A plus de Wiener lab. - Solución fisiológica (NaCl 9 g/l). Muestra Pueden utilizarse suero, plasma o LCR para la cuantificación, obtener el suero de la manera habitual, libre de hemólisis. También pueden usarse plasma o LCR. El plasma debe estar libre de hemólisis y de células ya que las plaquetas poseen elevadas concentraciones de DHL. En caso de que la muestra a emplear sea plasma, se recomienda el uso de heparina como anticoagulante. También puede utilizarse EDTA o citrato. En caso de utilizar EDTA, se ha demostrado que puede disminuir la actividad de la DHL hasta un 10%. Sustancias interferentes conocidas: No se observan interferencias por triglicéridos hasta 1400 mg/dl, bilirrubina hasta 30 mg/dl. La hemoglobina interfiere significativamente en todo su rango de concentraciones por lo que se recomienda usar muestras libres de hemólisis.

PROCEDIMIENTO (Analizador automático) LDH-L en un analizador automático. Cuando se implemente la técnica en un analizador en particular, siga las instrucciones de trabajo de este.

En una cubeta mantenida a la temperatura elegida (37°C), colocar: Muestra o Calibrador 4 μl + Reactivo A 100 μl Incubación durante 300 segundos a 37° C Reactivo B 20 μl Incubación durante 120 segundos a 37º C. [LDH] = (∆A/min) x factor; εNAD/NADH = 6230 M-1 cm-1 ε= Coeficiente de extinción Los analizadores Wiener lab. calculan automáticamente la actividad de DHL de cada muestra. El Calibrador A plus es procesado de la misma manera que las muestras y a partir de él se calcula el factor correspondiente. Se recomienda usar calibración a dos puntos después de cambiar lote de reactivo y cuando el control de calidad lo requiera. La reacción es lineal hasta 1000 U/l. Para valores superiores, diluir la muestra 1+4 partes con solución fisiológica (NaCl 9 g/l), repetir la determinación y multiplicar el resultado por el factor de dilución. Límite de detección: 4 U/l. Límite de cuantificación: 20 U/l. PARÁMETROS NORMALES EN SUERO Adultos 135 -240 U/l Niños (2 - 15 años) 120 -300 U/l Recién nacidos (4 a 20 días) 240 - 600 U/l Conversión al sistema internacional: LDH (U/l) x 0,0167 = LDH (μkat/l)

PRINCIPALES PATOLOGÍAS RELACIONADAS CON SUS ALTERACIONES. Debido a sus actividades generalizadas en diversos tejidos corporales, la LDH se eleva en una variedad de trastornos. Hay muchas condiciones que contribuyen a una mayor actividad de LDH. Un valor alterado de LDH total es un hallazgo inespecífico. El incremento de la LDH refleja varios fenómenos tales como: actividad osteoblástica, hemólisis, daño y necrosis celular, proliferación neoplásica, etc. De manera general, se enlistan a continuación, las principales enfermedades que cursan con elevación de la actividad de la LDH en suero. Trastornos cardiacos ●Infarto agudo al miocardio ●Miocarditis crónica Neoplasias

●Anemia de células falciformes ●Hemoglobinuria paroxística nocturna ●Anemias microangiopáticas ●Síndrome urémico hemolítico ●Postransfusión sanguínea

Leucemias ●Leucemia linfoblástica aguda ●Leucemia linfocítica crónica ●Leucemia mielomonocítica crónica Otros trastornos hematológicos ●Púrpura trombocitopénica trombótica ● Anemia megaloblástica ●Anemia diseritropoyética congénita Enfermedades infecciosas ●Mononucleosis infecciosa ●Neumonía por Pneumocystis jiroveci ●Histoplasmosis ●Malaria aguda ●Infección invasiva por trichinella spiralis ●Enfermedad de los legionarios (Legionella pneumophila) ●Síndrome pulmonar por hantavirus y SARS por coronavirus ●Influenza A estacional e influenza A aviar (H5N1) Trastornos neumológicos

●Sarcoidosis pulmonar ●Empiema complicado Cuadros inflamatorios ● Artritis reumatoide juvenil complicada ●Trastornos reumáticos agudos Padecimientos gastrointestinales ●Falla hepática aguda ●Hepatitis isquémica ● Pancreatitis aguda ● Obstrucción intestinal Trastornos osteomusculares ●Distrofias musculares ●Trauma muscular ● Miopatías metabólicas e inflamatorias Miscelánea ●Hipotiroidismo ●Crisis convulsivas ●Choque inducido por drogas (anestésicos, analgésicos narcóticos, procainamida, etanol

Cifras menores de DHL en suero Valores de baja actividad en suero de LDH se han informado sólo en pacientes con trasudados pleurales, así como en la glucogenosis XI que corresponde a la deficiencia congénita de esta enzima (Aranda Torrelio E. 2010).

Discusión: Esta enzima se ha cuantificado desde hace más de cuarenta años y su aplicación clínica fue gradual, conforme se observaron diferencias en sus valores en suero en diversos padecimientos agudos y crónicos. El uso de biomarcadores en medicina radica en su capacidad para detectar enfermedades y apoyar decisiones diagnósticas y terapéuticas. También tienen un valor potencial como importante herramienta de pronóstico. Los biomarcadores clínicamente útiles pueden complementar el diagnóstico clínico y ayudar a controlar la enfermedad, evaluar los tratamientos y predecir el pronóstico y el resultado de la salud. Los cambios en las enzimas e isoenzimas plasmáticas o séricas son indicadores útiles de daño

tisular en muchas enfermedades. Los aumentos de enzimas citoplasmáticas suelen estar relacionados con su fuga de las células dañadas. En los seres humanos, la actividad y liberación de un gran cuerpo de mediadores inflamatorios y marcadores de daño celular como la lactato deshidrogenasa (LDH o DHL, EC 1.1.1.27) se han evaluado como herramientas de pronóstico y monitoreo del desarrollo, actividad y progresión de la enfermedad (Tzouvelekis A, et al. 2005). Al tomar en cuenta su utilidad en la evaluación diagnóstica de un paciente se admite que la determinación de deshidrogenasa láctica (LDH) debe incluirse dentro de las pruebas de evaluación en infecciones agudas, así como en fiebre de origen desconocido. También es útil su determinación en linfoma No Hodgkin y varios expertos han incluido a esta prueba dentro de los índices pronósticos y su elevación se asociaría con evolución poco favorable o remisión a corto plazo; lo propio ocurre con su incremento observado en niños con Linfoma de Burkit invasivo; asimismo, su determinación es influyente para el estadiaje de los linfomas NoHodgkin y del melanoma cutáneo. Igualmente hay informes demostrativos de que cifras elevadas de DHL son un factor pronóstico adverso en linfomas, cáncer refractario de próstata y en leucemia linfoblástica aguda (Aranda Torrelio E. 2010). Dado que la LDH es una enzima presente en prácticamente todos los sistemas de órganos principales, la actividad de la LDH en suero es anormal en un gran número de trastornos. Por lo tanto, Los ensayos de LDH asumen un significado más específico cuando se separan en fracciones de isoenzimas, ya que su cuantificación total, tiene peso cuando se contrastan sus valores con otros biomarcadores, historia clínica y examen físico de ser necesario para poder llegar a un diagnóstico y tratamiento adecuado.

Conclusión: El uso de biomarcadores en medicina radica en su capacidad para detectar enfermedades y apoyar decisiones diagnósticas y terapéuticas. También tienen un valor potencial como importante herramienta de pronóstico. Los biomarcadores clínicamente útiles pueden complementar el diagnóstico clínico y ayudar a controlar la enfermedad, evaluar los tratamientos y predecir el pronóstico y el resultado de la salud. Los cambios en las enzimas e isoenzimas plasmáticas o séricas son indicadores útiles de daño tisular en muchas enfermedades. La deshidrogenasa láctica, más que apoyar el diagnóstico, debe considerarse un biomarcador de progresión, pero se necesitan más estudios para determinar apropiadamente su utilidad pronóstica acorde al paciente y el tipo de proceso patológico que se curse. Ante cifras muy elevadas de deshidrogenasa láctica, es prudente excluir cáncer en algún órgano o sistema porque ese hallazgo está más asociado con lisis celular continua, así como con proliferación anormal de clonas celulares y es muy útil para confirmar invasión metastásica de neoplasias refractarias a tratamiento.

Referencias: Klein, R., Nagy, O., Tóthová, C., & Chovanová, F. (2020). Clinical and Diagnostic Significance of Lactate Dehydrogenase and Its Isoenzymes in Animals. Veterinary Medicine International, 2020. Kaja, S., Payne, A. J., Naumchuk, Y., & Koulen, P. (2017). Quantification of lactate dehydrogenase for cell viability testing using cell lines and primary cultured astrocytes. Current protocols in toxicology, 72(1), 2-26. Aranda Torrelio, E. (2010). Interpretación de la deshidrogenasa láctica. Revista de la Sociedad Boliviana de Pediatría, 49(2), 132-134.

García-Arroyo, A., Rosas-Dossetti, M., Santoyo-Sánchez, A., Salcedo-Roldán, M., RamosPeñafiel, C. O. (2018). Deshidrogenasa láctica como factor pronóstico en neumonías. Medicina interna de México, 33(5), 563-571. Schumann, G., Bonora, R., Ceriotti, F., Ferard, G., Ferrero, C. A., & Franck, P. F. (2002). Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of gamma-glutamyltransferase. Clin Chem Lab Med, 40, 734-8. Tzouvelekis, A., Kouliatsis, G., Anevlavis, S., & Bouros, D. (2005). Serum biomarkers in interstitial lung diseases. Respiratory research, 6(1), 78....