5. Examen EN Fresco Y Coloraciones PDF

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análisis y forma de observacion de Examen EN Fresco Y Coloraciones...

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL COMAHUE FACULTAD DE CIENCIAS DEL AMBIENTE Y LA SALUD Licenciatura en Enfermería

Microbiología y Parasitología 2018

EXAMEN EN FRESCO Y COLORACIONES Objetivo: Que el alumno pueda: • • • • • •

Interpretar y Diferenciar un Examen en Fresco de una coloración Conocer la clasificación de las coloraciones: Simples y Compuestas Realizar los pasos necesarios de un preparado para una coloración a partir de un cultivo microbiológico: Extendido Fijación Coloración

INTRODUCCION Debido al tamaño de las bacterias y otros microorganismos es necesaria la observación, de los mismos, a través de un microscopio. Para esta observación podemos recurrir a varias opciones: • •

Examen en Fresco  Coloraciones Simples Coloraciones Compuestas.

Examen en Fresco: Es la forma más simple de preparar un espécimen para su examen microscópico. De esta forma podemos observar: • • •

Si el microorganismo es móvil o inmóvil En la mayoría de los casos la forma del microorganismo (Ej. Coco, bacilo) La forma de agruparse (de a pares, en cadenas, en racimos, etc.) Podemos prepararlos a partir de cultivos en Medios Líquidos o Sólidos.

Si partimos de un Medio líquido: tomamos una gota de la solución (medio de cultivo + Microorganismo), la colocamos en un portaobjeto, cubrimos con un cubreobjetos y observamos. Esta técnica es ampliamente utilizada en los Laboratorios de Microbiología para observar la movilidad de las bacterias. Si partimos de un Medio de Cultivo Sólido (agar), colocamos una gota de solución fisiológica estéril en un portaobjeto, tomamos una pequeña porción de la colonia, la disolvemos en la gota, homogeneizamos, colocamos el cubreobjetos y observamos. Página 1 de 6

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Esta técnica es utilizada para una visualización rápida de un microorganismo pero no es específica ya que requiere de destreza y en caso de especímenes muy pequeños es dificultosa. El Examen en fresco también es utilizado a partir de muestras biológicas de los pacientes y forman parte del informe. Como ej. Podemos citar: orina, líquido cefalorraquídeo, Exudados vaginales, Exudados Uretrales. Etc. COLORACIONES SIMPLES En las tinciones simples se utiliza un solo colorante. Este puede ser de carácter ácido o básico. Los más utilizados en Microbiología son de carácter básico como el azul de metileno. El colorante atraviesa la pared celular y se une químicamente con moléculas de bacteria (Ác. Nucléicos por ej.) Se utilizan para aumentar el contraste. Todas las células se tiñen del mismo color. Por lo tanto la tinción Simple permite mejorar la observación de la totalidad de la célula. Para realizar una tinción simple solo es necesario, a partir de un extendido fijado, exponer el colorante el tiempo necesario y se enjuaga con abundante agua, se deja secar y se observa. COLORACIONES COMPUESTAS Existen diversas coloraciones compuestas pero vamos a mencionar las dos más utilizadas en el laboratorio: Tinción de Gram y Ziehl Neelsen TINCION DE GRAM La tinción de Gram es la coloración más utilizada en Microbiología y fue desarrollada por Christian Gram en 1884. Esta coloración clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas. Esta diferencia no es casualidad sino resulta de las diferencias estructurales de la pared celular entre unas y otras.

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En las bacterias Gram Positivas tenemos una capa más gruesa de peptidoglicano que la presente en las Gram negativas. Etapas en la tinción de Gram Pasos

Resultados

Método

Gram(+)

Colorante básico

Violeta de genciana

Mordiente

Lugol

Decoloración

Alcohol de 95% o

Gram (-)

Se tiñe de violeta

Se tiñe de violeta

Permanece violeta

Permanece violeta

Permanece violeta

Se decolora

Alcohol-acetona Contraste

Fucsina o Safranina

Permanece violeta

Se tiñe de rosa

1. Se tiñe el espécimen con el primer colorante, cristal violeta, que tiñe de violeta. 2. Se añade el mordiente, yodo. 3. Se aplica el agente decolorante, normalmente una solución de acetona o etanol. En este momento, las bacterias Gram negativas pierden su tinción violeta, pero las Gram positivas retienen el colorante. 4. Como colorante de contraste se añade safranina, que tiñe de rosa las bacterias Gram negativas, previamente decoloradas; mientras que a las bacterias Gram positivas les proporciona un color violeta más intenso. Esta coloración es sin duda alguna el comienzo en la compleja tarea de tipificar un germen. Página 3 de 6

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Podemos decir que las bacterias se clasifican: • • • • •

Según su forma: Cocos Bacilos Espirilos Vibrios

•

Según su agrupamiento

Tanto cocos como bacilos pueden agruparse de distinta manera. La forma de agruparse también es parte de la tipificación y podemos verla en una coloración de un cultivo de medio líquido.

• • •

Según coloración : Gram positivos Gram negativos Página 4 de 6

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GRAM POSITIVO

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GRAM NEGATIVO

COLORACION DE ZIEHL NEELSEN El fundamento de esta técnica diferencial, se basa en la propiedad de la ácidoalcohol resistencia de algunas bacterias del orden Actinomycetales, si bien no es privativa de ellas. Estos microorganismos se consideran grampositivos, pero se colorean difícil e irregularmente, de ahí que emplee este tipo de tinción (Ziehl- Neelsen) o su variante (Kinyoun). Cualquiera de las dos técnicas citadas consiguen, ya sea por el calor o aumentando el tiempo de contacto, que la fucsina penetre profundamente y pueda resistir la acción decolorante de una solución de ácidoalcohol, apareciendo los bacilos de color rojo sobre un fondo azul (tabla 2). 1. Tinción primaria con fucsina básica, que tiñe todas las células de rojo. 2. Calentamiento suave de la preparación para facilitar la penetración del colorante en el interior de la célula. 3. Decoloración con una solución de ácido clorhídrico en etanol. Este decolorante elimina la fucsina de todas las células excepto de las mico bacterias, que la retienen debido a su superficie cérea. 4. Coloración de contraste con azul de metileno. Se tiñen de azul todas las células previamente decoloradas, lo que facilita la diferenciación entre las células de Mycobacterum, aún teñidas de rojo, y las células restantes.

Etapas en la tinción de Ziehl- Neelsen Resultados Página 5 de 6

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Acido-alcohol Pasos

Método

Colorante básico Fucsina

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No ácido alcohol

resistente

resistente

Se tiñe de rojo

Se tiñe de rojo

Mordiente

Calor

Permanece rojo

Permanece rojo

Decolorante

Alcohol-clorhídrico

Permanece rojo

Se decolora Contraste

Azul de metileno

Permanece rojo

Se tiñe de azul

Esta coloración se utiliza para el diagnostico de Tuberculosis (bacilo de Koch).

Actividades 1. Preparación de examen en fresco de microorganismos y observación al microscopio. 2. Preparación de extendidos, fijación y tinción con coloraciones de Gram y Ziehl Neelsen. 3. Observación microscópica.

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