Microbiologia( microscopio tipo y sus partes, preparacion en fresco)pr PDF

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MICROSCOPIO...

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UUNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS CARRERA EN QUIMICA Y FARMACIA

TEMA:  OBSERVACIONES AL MICROSPIO  TECNICAS DE OBSERVACION SUBTEMAS 1.-EL MICROSCOPIO.- TIPOS Y PARTES 2.- PREPARACIONES EN FRESCO O HUMEDAS 3. PREPARACIONES TEÑIDAS: 3.1FROTIS 3.2FIJACION 3.3 TINCION 3.4LOS COLORANTES 3.5TINCION SIMPLE 4.- TINCION DOBLE O DIFERENCIAL 4.1 TECNICA DE GRAM 4.2 TINCION DE ALCOHOL ACIDO RESISTENTE 4.3 TINCION DE BACTERIAS ESPORULADAS.- TINCION DE LA TINTA CHINA

INTEGRANTES  ALEJANDRO ALMEIDA SAMANTHA  HEREDIA CABRERA EVELYN  PARRAGA LOOR PAUL GRUPO 2 – SUBGRUPO Nº 3 DOCENTE Q.F MARIANITA DE JESUS RENDON MARISCAL MS. C 5to SEMESTRE G2 1

2018 - 20 Contenido 1.

El Microscopio......................................................................................................................4 MICROSCOPIO COMPUESTO..........................................................................................4 MICROSCOPIO ÓPTICO O LIVIANO..............................................................................4 MICROSCOPIO DIGITAL...................................................................................................4 MICROSCOPIO FLUORESCENTE...................................................................................5

PARTES DEL MICROSCOPIO..........................................................................................................5 OCULAR:...............................................................................................................................5 El TUBO:................................................................................................................................6 REVÓLVER:..........................................................................................................................6 BRAZO...................................................................................................................................6 PLATINA................................................................................................................................6 OBJETIVO.............................................................................................................................6 PINZAS DE SUJECIÓN:......................................................................................................6 CONDENSADOR:.................................................................................................................7 TORNILLOS DE ENFOQUE:..............................................................................................7 BASE.......................................................................................................................................7 2.

PREPARACIONES EN FRESCO O HÚMEDAS...........................................................................7

3.

PREPARACIONES TEÑIDAS....................................................................................................8

3.1 FROTIS..................................................................................................................................8 3.2 FIJACION........................................................................................................................9 3.2

TINCION....................................................................................................................9

3.4 LOS COLORANTES.......................................................................................................9 3.5 TINCION SIMPLE..........................................................................................................9 4. TINCIÓN DIFERENCIAL:...........................................................................................................10 4.1 TECNICA DE GRAM....................................................................................................10 4.2 TINCION ALCOHOL ÁCIDO RESISTENTE (ZIEHL-NEELSEN)........................11 4.3 TINCION DE BACTERIAS..........................................................................................11 4.4 TINCION CON TINTA CHINA....................................................................................12 5. RECOMENDACIONES..............................................................................................................13 6.CONCLUSIONES.......................................................................................................................13 Bibliografía.................................................................................................................................13

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1. El Microscopio El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño. Es el instrumento que más se usa en los laboratorios que estudian los microorganismos. Si pensamos en un laboratorio ya se químico, clínico, biológico o científico en general, lo primero que se nos viene a la mente es un microscopio, pues hay que conocer al instrumento más común del laboratorio. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño original. El microscopio existe en varias formas como: MICROSCOPIO COMPUESTO. Es un aparato óptico hecho para agrandar objetos, consiste en un número de lentes formando la imagen por lentes o una combinación de lentes posicionados cerca del objeto, proyectándolo hacia los lentes oculares u el ocular. MICROSCOPIO ÓPTICO O LIVIANO. Es un tipo de microscopio compuesto que utiliza una combinación de lentes agrandando las imágenes de pequeños objetos. Los microscopios ópticos son antiguos y simples de utilizar y fabricar.

MICROSCOPIO DIGITAL.

Tiene una cámara CCD adjunta y está conectada a un LCD, o a una pantalla de computadora. Un microscopio digital usualmente no tiene ocular para ver los objetos directamente.

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MICROSCOPIO FLUORESCENTE.

Es un tipo especial de microscopio liviano, que en vez de tener un reflejo liviano y una absorción utiliza fluorescencia y fosforescencia para ver las pruebas y sus propiedades.

PARTES DEL MICROSCOPIO

MICROSCOPIO CON SUS PARTES. OCULAR:Lente situada cerca del ojo del observador (por donde mira). Su misión es ampliar la imagen del objetivo. Suelen tener dos oculares, por eso se llaman binoculares, si solo tiene uno se llama monocular.

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El TUBO:El tubo óptico se puede acercar o alejar de la preparación (lo que se quiere ver) mediante un TORNILLO

MACRO

MÉTRICO

o

de

grandes

movimientos que sirve para realizar un primer enfoque.

REVÓLVER:Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. La esfera se suele llamar CABEZAL y contiene los sistemas de lentes oculares (monoculares o binoculares (2 lentes).

BRAZO: Es una pieza metálica de forma curvada que puede girar; sostiene por su extremo superior al Tubo Óptico y en el inferior lleva varias piezas importantes.

PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación que se quiere observar. Tiene en su centro una abertura circular por la que pasará la luz del sistema de iluminación.

OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta determinando las cantidades de aumentos con la que queremos observar.

PINZAS DE SUJECIÓN:Parte mecánica que sirve para sujetar la preparación. La mayoría de los microscopios modernos tienen las pinzas adosadas a un carro con dos tornillos, que permiten un avance longitudinal y transversal de la preparación.

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CONDENSADOR:Lente que concentra los rayos luminosos que inciden sobre la preparación. El condensador de la parte de abajo también se llama FOCO y es el que dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

TORNILLOS

DE

ENFOQUE:Macrométrico

que

aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto.

BASE: Sujeccion de todo el microscopio.

ESPEJO con una cara plana y otra cóncava, está montado sobre un eje giratorio ubicadoen la zona más inferior del brazo por debajo de la Platina.[CITATION RLb15 \l 3082 ]

2. PREPARACIONES EN FRESCO O HÚMEDAS. La forma más simple de preparar un espécimen para su examen microscópico es hacer una preparación en fresco. Existen dos técnicas, una preparación en fresco simple ("entre porta y cubre") consiste en colocar una gota de líquido con los microorganismos sobre un portaobjetos y a continuación cubrirla con un cubreobjetos. Una preparación en gota pendiente se realiza colocando una gota del material en un cubreobjetos y cubriéndolo con un portaobjetos (invertido) con una excavación central (portaobjetos excavado). Hay que sellar la preparación con vaselina alrededor de la excavación. La ventaja de esta última técnica, es que la preparación no se seca y puede ser observada durante un tiempo más largo. 6

Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos. Por ejemplo, para la búsqueda de Trichomonasvaginalis en secreciones vaginales. Este protozoo de gran movilidad causa inflamación de la vagina y la uretra. Si en la preparación se observan células en forma de huso que se mueven mediante contracciones o sacudidas cruzando el campo, probablemente se tratará de T. vaginalis, pudiéndose efectuar el diagnóstico. Sin embargo, el inconveniente de la observación en fresco es que no permite aumentar el contraste de la preparación. Por tanto, su uso, con un microscopio óptico de campo claro, está bastante limitado. Normalmente, para observar microorganismos vivos se utiliza alguno de los otros microscopios ópticos que hemos mencionado anteriormente.

3. PREPARACIONES TEÑIDAS La preparación consiste en una capa de la muestra extendida sobre un portaobjetos libre de grasa. Estapreparación debe ser lo suficientemente delgada para permitir el paso de la luz a través de ella. Los extendidos o frotes se dejan secar al aíre; para asegurar que las células queden adheridas alportaobjetos y no se desprendan durante los lavados que se realizan durante la tinción; la preparación sefija con calor moderado, pasando el portaobjetos 5 o 6 veces sobre la flama del mechero, o adicionandosustancias deshidratantes y/o precipitantes como metanol o cloruro mercúrico, procediendo a hacer latinción. Esta puede ser: Positiva: Cuando se colorea directamente a los microorganismos o a las estructuras en estudio;utilizan colorantes. Negativa: Cuando se oscurece el fondo de la preparación y se observa la silueta incolora de losmicroorganismos.

3.1 FROTIS Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a teñir (si es líquido) o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra. Puede usarse una aguja estéril para transferir una pequeña cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de agua o solución salina previamente colocada sobre el portaobjetos. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta que el vidrio esté tan caliente que moleste al tacto pero no queme.

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3.2FIJACION La fijación, procedimiento que permite preservar estructuras celulares, se puede llevar a cabo con diferentes tratamientos: fijación por calor o fijación química. La fijación por calor es la más utilizada para la observación de bacterias. Este procedimiento consiste en pasar el portaobjetos, con la suspensión bacteriana extendida y seca, a través de una llama de un mechero. La fijación por calor preserva la morfología externa de los microorganismos pero no las estructuras internas. La fijación química con agentes como etanol, folmaldehido y ácido acético entre otros muchos, se utiliza para preservar las estructuras celulares. [ CITATION ser13 \l 12298 ]

3.2 TINCION Se pueden utilizar dos tipos de procedimientos, la tinción positiva es la más frecuente, en ella un colorante se une a ciertas estructuras microbianas. Todos los colorantes utilizados en microbiología tienen en común la presencia de grupos cromóforos, grupos con dobles enlaces conjugados que son los responsables del color mediante la unión a estructuras celulares por enlaces iónicos, covalentes o hidrófobos, los que establecen enlaces iónicos son los más frecuentes. Entre los colorantes que se unen por enlaces covalentes destaca el reactivo de Schiff, utilizado para la tinción de DNA, donde el colorante se une a la desoxi-ribosa. Por otra parte, en la tinción negativa se utilizan compuestos que no penetran en las células sino que impregnan el medio circundante. Los microorganismos aparecen refringentes sobre un fondo negro.[ CITATION Edg17 \l 12298 ]

3.4LOS COLORANTES Compuestos coloridos que al combinarse con otras sustancias les imparten color; están formados por un grupo cromóforo que es la parte responsable del color, y un grupo auxócromo que al formar sales le permite disociarse y combinarse. Mordente : compuesto químico intensificador de color.

3.5TINCION SIMPLE En las tinciones simples se usa un único colorante, que siempre es de tipo básico como safranina, azul demetileno o cristal violeta. Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las c élulas absorberán el colorante y quedarán teñidas del mismo 8

color. Por tanto, la tinción simple mejora laobservación de la célula completa. Se fija el espécimen, se añade el colorante y se deja el tiempoadecuado para que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparación ya está lista para ser observada. Si se utiliza un mordiente, hay que añadirlo justo antes del colorante.

4. TINCIÓN DIFERENCIAL: El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre células bacterianas o entre partes de una misma célula, estas técnicas utilizan más de un colorante o bien ciertos reactivos complementarios para la tinción. Los ejemplos clásicos sería la tinción de GRAM la de Ziehl-Neelsen

o

Los colorantes más usados son: azul de metileno, cristal violeta, safranina, estos son catiónicos y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente, como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso conocido como fijación. Después de esta habitualmente se realiza la tinción. La fijación produce generalmente encogimiento de las células, la tinción por el contrario, hace que las células parezcan mayores de lo que son realmente

4.1 TECNICA DE GRAM La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram (1853-1938), que desarrolló la técnica en 9

1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana, como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose bacterias gram positivas a las que se visualizan de color morado, y bacterias gram negativas a las que se visualizan de color rosa, rojo o grosella.

Esta tinción pone de manifiesto la afinidad tintorial de la pared, la cual depende de su composición para que el microorganismo sea considerado gram+ o gram-. Los microorganismos grampositivos se diferencian de los gramnegativos en que tienen más mureína, una pared celular monoestratificada y presencia de ácidos teitoicos. Los gram- tienen menos mureína, una pared celular biestratificada y no tienen ácidos teitoicos.

Esta técnica sirve, junto a la morfología, para clasificar las bacterias como:    

Cocos grampositivos. Bacilos grampositivos. Cocos gramnegativos. Bacilos gramnegativos.

TECNICA 1. Recoger muestras para ubicarlas en el microscopio. 2. Hacer el extendido con un palillo de madera 3. Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero 4. Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado tres veces aproximadamente). 5. Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar un minuto. 6. Enjuagar con agua no directamente sobre la muestra 7. Agregar lugol y esperar un minuto aproximadamente. 8. Agregar alcohol acetona y esperar entre 5 y 30 segundos según la concentración del reactivo (parte crítica de la coloración). (las gram - se decoloran, las gram + no) 9. Lavar de nuevo con agua destilada para retirar los restos de alcohol/acetona. 10.Teñir la preparación con safranina durante 1 minuto. 11. Lavar con agua destilada hasta eliminar el exceso de colorante. 12.Observar al microscopio óptico y finalmente identificar los microorganismos como grampositivos o gramnegativos. Procedimiento

Gram +

Gram -

Observación Las

bacterias

gram

10

Paso 1. Colorante fundamental: cristal violeta durante 1 minuto. Paso 2. Mordiente, solución de yodo y ioduro potásico, 1 minuto.

Paso 3. Decoloración, lavado con etanol, 30 segundos.

Paso 4. Colorante de contraste, safranina 1 minuto.

positivas y gran negativas se tiñen de violeta. Las bacterias gram positivas y gran negativas se tiñen de violeta. Las bacterias gram positivas mantienen el color violeta, las gram negativas pierden el colorante. Las bacterias gram negativas se tiñen de rojo, las gram positivas mantienen su color violeta.

RESULTRADOS

Esta tinción pone de manifiesto la afinidad tintorial de la pared, la cual depende de su composición para que el microorganismo sea considerado gram+ o gram-.

4.2 TINCION ALCOHOL ÁCIDO RESISTENTE (ZIEHL-NEELSEN) Es una tinción diferencial ideada por dos médicos alemanes, Franz Ziehl , un

bacteriólogo, y Friedrich Neelsen, un patólogo. Su finalidad es la de identificar mycobacterias (fuertemente ácido-alcohol resistentes), nocardias (débilmente AAR), actinomices (débilmente AAR) o parásitos como cryptosporidium. Las bacterias ácido-alcohol resistentes no pueden ser clasificados según la tinción de Gram, la técnica más común en la microbiología actual. Sin embargo pueden ser teñidas con algunas tinciones combinadas con calor, como la de Ziehl-Neelsen. Una vez teñidas tienen la capacidad de resistir la decoloración de una combinación de alcohol/ácido, el decolorante más común en los protocolos de tinción de bacterias. En la práctica realizamos la tinción tradicional, aunque existen dos variantes más. Una de ellas es la denominada variante en frío o Tinción de Kinyoun . Y la otra es la variante histológica destinada a la búsqueda e identificación de microorganismos AAR en tejidos. TECNICA: 1. Realizar un frotis bacteriano de la cepa de mycobacterium phlei y fijar la extensión con calor. 2. Añadir el primer colorante: Carbofucsina. 3. Se pasa por el mechero varias veces, durante cinco minutos, sin permitir que hierva el colorante. 4. Decantar y lavar con agua destilada el exceso de colorante. 5. Decolorar con alcohol/ácido hasta que la muestra tenga un color rosado. 6. Lavar con agua destilada. 7. Teñir con el colorante azul de metileno durante un minuto. 8. Lavar con agua destilada hasta retirar el exceso de colorante. 9. Secar la extensión al aire. 10.Observar al microscopio óptico y anotar los resultados. Procedimiento

AAR

no AAR

Observación

Paso 1. Colorante fundamental: fuchina fenicada y calor 5 minutos

Todas las bacterias se tiñen con este colorante de color rosa intenso

Paso 2. Decoloración, alcohol y ácido

Las bacterias AAR mantiene su color rosa intenso y las no AAR son decoloradas

Paso 3. Colorante de contraste, azul de metileno, 1 minuto

Las bacterias no AAR se tiñen de azul, las AAR mantienen su color rosa intenso

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RESULTADOS

4.3 TINCION DE...