Algas prac. de tinción - Las tinciones selectivas son aquéllas que permiten observar un organelo celular PDF

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Las tinciones selectivas son aquéllas que permiten observar un organelo celular determinado. Algunas bacterias tienen la capacidad de producir endosporas y cápsulas. Los primeros son organelos de resistencia que se caracterizan por presentar una capa externa formada por un complejo de calcio, ácido ...

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGÍA DE PROTISTAS Y ALGAS Grupo: 5021 Semestre: 2019-2 Práctica : Preparaciones permanentes

Integrantes: Calderón Cuevas Pamela Yamileé, Calixto Olvera Jazmín, Durán Toribio Ana Karla, Gabriel Vázquez Jacqueline, Ortíz Miranda Ricardo Introducción El tamaño de los microorganismos impide detectarlos a simple vista, por lo que es esencial el uso del microscopio. Para que un objeto pueda ser percibido a través del microscopio, este debe poseer cierto grado de contraste con el medio circundante. Para aumentar el contraste de los microorganismos y lograr una mejor observación de los mismos, se emplean diferentes preparaciones y técnicas de tinción. Las preparaciones pueden ser húmedas o frotes fijos, las primeras se utilizan para observar movilidad y en ambos casos la adición de colorantes, al aumentar el contraste, permite una mejor observación. Por ejemplo en el estudio microscópico de los protozoos se utilizan colorantes vitales y supravitales que tiñen ciertas estructuras como se expone en el cuadro 1.

Los colorantes vitales permiten observar movilidad, así como algunos de sus organelos o inclusiones teñidas, sin daño aparente; estos se preparan en soluciones acuosas o alcohólicas muy diluidas. En tanto que los colorantes supravitales, aun cuando tienen la ventaja de hacer más evidentes algunos organelos, presentan el inconveniente de afectar la viabilidad de los organismos. Estos colorantes varían en su composición y consisten en mezclas de reactivos que incluyen el colorante, ácidos, aldehídos, alcoholes y agua. Los primeros se aplican directamente en la muestra, en tanto que para los supravitales se recomienda aplicar una pequeña cantidad del colorante al portaobjetos y dejar secar y posteriormente colocar la muestra. Para que la aplicación del colorante sea uniforme, se recomienda extenderlo con la ayuda de otro portaobjetos.

Cuadro 1. Colorantes más frecuentes empleados para la observación de protozoos Existe un gran número de tinciones las que se aplican con objetivos específicos, de las cuales a continuación se exponen algunos ejemplos. La reacción a la tinción de Gram y de Ziehl-Neelsen se basa en la composición y estructura de la pared celular, que determina que unas bacterias retengan el primer colorante, en tanto que otras lo pierdan, lo que les permite reaccionar con el colorante de contraste. Las tinciones selectivas son aquéllas que permiten observar un organelo celular determinado. Algunas bacterias tienen la capacidad de producir endosporas y cápsulas. Los primeros son organelos de resistencia que se caracterizan por presentar una capa externa formada por un complejo de calcio, ácido dipicolínico y peptidoglicano. Debido a esta composición, es muy difícil que los colorantes penetren, por lo que al aplicar una tinción simple, estas aparecen como cuerpos incoloros (dentro o fuera de la célula). No obstante es posible teñirlas mediante la aplicación de métodos drásticos. Respecto a la cápsula, esta es una cubierta extracelular constituida por agua y polisacáridos que se acumulan alrededor de la célula. Estos componentes no se combinan con los colorantes, por lo que para la observación de la misma se emplean tinciones negativas con las que se oscurece el fondo y de esta manera se contrastan las cápsulas. (Química, 2012) Objetivos ● Realizar diferentes preparaciones microbiológicas a partir de muestras naturales.

Materiales y métodos De las muestras recolectadas previamente de la Cantera y del Jardín botánico se escogieron determinados protozoos de estudio. ● Técnica de Giemsa (Tinción utilizada frecuentemente para parásitos, permitiendo ver mejor el núcleo y flagelo). Colorante de Giemsa

Frasco oscuro

Alcohol metílico 30 ml

Metanol absoluto

Glicerina 10 ml

Bálsamo de Canadá o euparal

Giemsa 0.25 g En un portaobjetos se hizo un frotis y se dejó secar al aire, posteriormente para fijar a los protozoos se cubrió con metal absoluto durante 1 minuto, se escurrió. Después se tiñó con el colorante de Giemsa de 1 a 30 minutos, se volvió a dejar escurrir. Para terminar se lavó con agua destilada, después con agua corriente y se dejó al último secar completamente al aire. ● Técnica de hematoxilina de Harris (sirve para diferenciar el núcleo y citoplasma). Fijador Nissenbaum

Formol al 5%

Cloruro mercúrico o bicloruro de mercurio (solución acuosa saturada-60 g en un litro de agua destilada) 10 ml

Cloruro de magnesio al 8%

Ácido acético glacial 2 ml

Hematoxilina de Harris (Sigma)

Formol comercial 2 ml

Alcohol etílico 50%, 70%, 96% y absoluto

t-butanol 10 ml

Xilol Bálsamo de Canadá o euparal

Se colocó en un portaobjetos una gota de la muestra con el organismo de interés y se le agregó una gota de cloruro de magnesio al 8% aproximadamente durante 10 minutos hasta ver secar. Para la adhesión de los organismos se puede utilizar la albúmina, dónde s e agrega una gota del fijador Nissenbaum o formol al 5% durante 5 minutos. Se lava con agua destilada durante 5 minutos dos veces. Después se tiñe con la hematoxilina de Harris 5 minutos (se le agrega solamente donde se puso la gota con los organismos). Posteriormente se lava con agua de la llave y se deja escurrir, se vuelve lavar con agua destilada y por igual se deja escurrir. Terminando esto se deshidrata con alcohol del 50% 70% y 96% durante 5 minutos cada uno y posteriormente con alcohol absoluto 5 minutos (este último pasó 2 veces). Al terminar

se aclara con xilol 2 veces, 5 minutos cada vez. ● Técnica nigrosina-cloruro de mercurio-formol (NMF) de Borror (1968, 1969) (Tinción utilizada para destacar cinetosomas, cilios, fibras citoplásmicas y ornamentaciones superficiales). Cloruro de magnesio 8%

Solución Nissenbaum

Solución Deroux- Faidy

Fijador- colorante

Solución acuosa saturada de bicloruro de mercurio 10 ml

Formol comercial 40 ml

Frasco oscuro

Ácido acético glacial 2 ml

Nigrosina 4g

Alcoholes 70%, 80%, 96%, 100%

t-butanol 10 ml

Agua destilada 100 ml

Xilol

Formol comercial 2 ml

Bálsamo de Canadá o euparal Cómo primer paso se tienen que concentrar los protozoos, esto se logra centrifugando el cultivo o la muestra escogida durante 2 a 5 minutos a 150-500 rpm (depende del tipo de protozoo en estudio) y decantando el sobrenadante para que posteriormente bajo el microscopio estereoscópico se recolecten los protozoos y se concentren en un vidrio de reloj. Posteriormente colocar con una pipeta 1 o 2 gotas del concentrado sobre un portaobjetos y se agrega cloruro de magnesio al 8% por 5 a 10 minutos, se puede dejar ese tiempo para que se evapore el líquido y se adhieran los organismos al portaobjetos o inmediatamente después se agrega el fijador-colorante (2-3 gotas a una altura de 2-3 cm en posición perpendicular a la preparación). Después de uno segundos se agrega varias gotas del fijador-colorante en uno de los extremos del portaobjetos, dejando que corra al centro del portaobjetos, transcurridos de 15 a 25 segundos se escurre el exceso.Al terminar se empieza a deshidratar en alcoholes de 70% 80% 96% y absoluto de 3-5 minutos en cada uno. Se aclara con xilol durante 5 minutos dos veces. ● Técnica de nitrato de plata “en seco” de Klein (1926, 1958) (Utilizada para destacar el sistema de líneas argénticas (argiroma)). Nitrato de plata 5%

Bálsamo de Canadá o euparal

Lámpara de rayos ultravioletas

Se coloca una gota de la muestra sobre un portaobjetos, Se extiende con una aguja de disección y se deja secar. Después se le coloca la solución de nitrato de Plata al 5% y se deja transcurrir 5 minutos. Posteriormente se lava en agua destilada 2 veces y se coloca en una caja petri con agua destilada bajo la lámpara de rayos ultravioleta durante 5 minutos (se coloca una hoja Blanca debajo de la caja Petri). Ha transcurrido ese tiempo se lava nuevamente con agua destilada y se deja secar al aire.

Resultados La tinción se hizo con verde de metilo en una muestra de la Cantera. Los organismos que se observaron Vorticella y Paramecium, se muestran en las figuras al final del documento, donde se señala el núcleo y otras estructuras que presentan. En la siguiente imagen (imagen 1) solo se muestra un individuo de Vorticella, el cual tiene el macronúcleo teñido de color rojo oscuro.

Imagen 1. Vorticella

Las preparaciones permanentes se realizaron con nitrato de plata “en seco” de Klein y se obtuvieron 4 diferentes, de las cuales algunas se tomaron del JB y otras de la Cantera. Discusión Cuando se trabaja con microorganismos, es de suma importancia que se lleven a cabo técnicas de tinción debido a que estas nos ayudan con la identificación de distintas partes del organismo que se está observando y por lo tanto nos facilita el trabajo, principalmente si se está trabajando con un microscopio óptico en el cual la observación de estructuras específicas se puede volver un trabajo complicado. Para ello nos sirve conocer las distintas técnicas y la tinción que se puede utilizar según la estructura u organismo de interés. Conclusión La preparación de muestras permanentes es fundamental para la identificación del organismo, así como para su observación para posteriores estudios. Para la realización de la práctica se utilizaron muestras donde se observaron mayor cantidad de protozoos. De la muestra a la que se le realizó la tinción con verde de metilo se pudo observar el núcleo; en las preparaciones permanentes se pudo conservar los organismos objetivos. Bibliografía ● Química, F., 2012. depa.fquim.unam.mx. [En línea] Obtenido de: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Practica_preparaciones_microbiologicas_ 18855.pdf [Último acceso: 24 Abril 2019]....