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TINCIÓN DE GIEMSA La tinción de Giemsa es un tipo de coloración de muestras clínicas, basada en la mezcla de colorantes ácidos y básicos. Su creación estuvo inspirada por el trabajo realizado por Romanowsky, donde Gustav Giemsa, químico y bacteriólogo originario de Alemania, la perfeccionó agregando glicerol para estabilizar los compuestos. Los cambios generados a la técnica original de Romanowsky permitieron mejorar considerablemente las observaciones microscópicas, por lo tanto la técnica fue bautizada con el nombre de tinción de Giemsa. Por ser una técnica sencilla de realizar, de gran funcionabilidad y económica es actualmente muy utilizada en el laboratorio clínico para frotis hematológicos, muestras de médula ósea y cortes de tejido. La técnica de tinción de Giemsa es muy útil para estudios citológicos, ya que permite la observación de estructuras específicas de las células. Esta técnica tiñe los citoplasmas, núcleos, nucléolos, vacuolas y gránulos de las células, pudiéndose distinguir incluso finas trazas de cromatina. Además, se pueden detectar cambios significativos en el tamaño, forma o coloración del núcleo, donde es posible visualizar la pérdida de la relación núcleo – citoplasma. Por otra parte, permite identificar células inmaduras en médula ósea y sangre periférica, siendo importante para el diagnóstico de enfermedades graves como la leucemia. También es posible detectar hemoparásitos, bacterias extra e intracelulares, hongos, entre otros. En citogenética es bastante utilizada, ya que es posible estudiar la mitosis de las células.

Fundamento de la coloración de Giemsa Los colorantes tipo Romanowsky tienen como fundamento utilizar un contraste entre colorantes ácidos y básicos, para lograr teñir las estructuras básicas y ácidas respectivamente. Como se puede observar existe una afinidad de los colorantes ácidos a teñir las estructuras básicas y viceversa. El colorante básico utilizado es el azul de metileno y sus derivados oxidados (Azure A y Azure B), mientras que el colorante ácido es la eosina. Las estructuras ácidas de las células son los ácidos nucleicos, los gránulos de los segmentados basófilos, entre otras, por tanto serán teñidos con el azul de metileno. En este mismo sentido, las estructuras básicas de las células son la hemoglobina y algunos gránulos como los contenidos en los segmentados eosinófilos, entre otras; estos serán teñidos con la eosina. Por otra parte, debido a que el azul de metileno y el azure se caracterizan por ser colorantes metacromáticos, estos pueden brindar una tonalidad variable a las distintas estructuras de acuerdo a la carga de polianiones que posean. Es así como la combinación estratégica de colorantes básicos y ácidos logran desarrollar una amplio espectro de colores, de acuerdo con las características bioquímicas de cada estructura, paseándose por tonalidades azules pálidas, azules oscuras, lila y púrpura en el caso de las estructuras ácidas. Mientras que la coloración que brinda la eosina es más estable, generando colores entre rojizonaranja y salmón. Materiales Materiales para la preparación de la solución madre La preparación de la solución madre requiere pesar 600 mg de colorante Giemsa en polvo, medir 500 cc de alcohol metílico libre de acetona y 50 cc de glicerina neutra. Modo de preparación de la solución madre Colocar el polvo de Giemsa pesado en un mortero. Si existen grumos se deben pulverizar. Posteriormente agregar una cantidad apreciable de la glicerina medida y mezclar muy bien. La mezcla obtenida se vierte a un frasco color ámbar muy limpio. El resto de la glicerina se coloca en el mortero. Volver a mezclar para limpiar el resto de colorante que haya quedado pegado a las paredes del mortero y echar al mismo frasco.

El frasco se tapa y se lleva durante 2 horas en baño maría a 55 ºC. Mientras se encuentre en baño de maría, realizar ligeras agitaciones de la mezcla cada media hora aproximadamente. Posteriormente, se deja enfriar la mezcla para colocar el alcohol. Previamente, una parte del alcohol medido se coloca en el mortero para terminar de lavar lo que quede de colorante y seguidamente se adiciona a la mezcla junto al resto del alcohol. Esta preparación se debe dejar madurar durante al menos 2 semanas. La porción que se vaya utilizando de la solución madre debe ser filtrada. Para evitar la contaminación del preparado, se recomienda pasar la porción que va a estar en constante uso a un frasco ámbar pequeño con gotero. Recargar cada vez que se agote el reactivo. Materiales para preparar la solución Buffer Por otra parte, se prepara una solución buffer a pH 7,2 de la siguiente manera: Se pesan 6,77 gr de fosfato de sodio (anhidro) (NaHPO4), 2,59 gr de fosfato dihidrógeno de potasio (KH2PO4) y agua destilada hasta 1000 cc. Preparación final del colorante Para la preparación de la solución final de tinción se miden 2 cc de la solución madre filtrada y se mezclan con 6 cc de la solución buffer. Se agita la mezcla. Un dato relevante que hay que tener en cuenta, es que las técnicas de preparación del colorante pueden cambiar según la casa comercial. Materiales adicionales necesarios para realizar la coloración A parte de los materiales descritos, se debe disponer de puentes de coloración, pisetas con agua o buffer para el lavado, láminas porta objetos o cubre objetos, un cronómetro para controlar los tiempos de coloración y papel secante o algún material que sirva para secar (gasa o algodón). Técnica Proceso de tinción 1) Previo a la coloración se debe tener listo el extendido de la muestra sobre un portaobjetos limpio.

Las muestras pueden ser sangre, médula ósea, cortes de tejidos histológicos o muestras cervicovaginal. Se recomienda que los extendidos sean finos y tengan 1 o 2 horas de secado antes de colorearlos. 2) Sobre un puente de coloración se colocan todas las láminas que se tengan para colorear. Se trabaja siempre en un mismo orden y se identifica bien cada lámina. 3) Colocar unas gotas de alcohol metílico al 100% (metanol) sobre el frotis y dejar actuar por 3 a 5 minutos, con el fin de fijar y deshidratar la muestra. 4) Descartar el metanol presente en la lámina y dejar secar al aire. 5) Una vez seco colocar con un gotero la solución final de tinción hasta cubrir la totalidad de la lámina. Dejar actuar por 15 minutos. Algunos autores recomiendan hasta 25 min. Depende de la casa comercial. 6) Escurrir el colorante y lavar el frotis con agua destilada o con solución buffer a 7,2. 7) Sobre un papel secante dejar secar las láminas al aire libre, dispuestas en forma vertical con ayuda de un soporte. 8) Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodón humedecido en alcohol para eliminar cualquier resto de colorante. Utilidades La técnica de tinción de Giemsa es utilizada en diversas áreas, entre ellas: en hematología, micología, bacteriología, parasitología, citología y citogenética. Hematología Es la utilidad más frecuente que se le da a esta tinción. Con ella se logran identificar todas y cada una de las células presentes en muestras de médula ósea o sangre periférica. Así como estimar el número de cada serie, pudiéndose detectar leucocitosis o leucopenia, trombocitopenia, etc. Debido a que es sensible para identificar células inmaduras, es relevante en el diagnóstico de leucemias agudas o crónicas. También es posible hacer el diagnóstico de anemias, como la anemia drepanocítica, falciforme, entre otras.

Micología En esta área es común su utilización para la búsqueda de Histoplasma capsulatum (hongo dimórfico intracelular) en muestras de tejidos. Bacteriología En frotis hematológicos teñidos con Giemsa es posible detectar Borrelias sp en pacientes que cursan con la enfermedad denominada fiebre recurrentis. Las espiroquetas se observan abundantes entre los eritrocitos, en muestras tomadas en el pico febril. También es posible visualizar bacterias intracelulares como Rickettsias sp y Chlamydia trachomatis en células infectadas. Parasitología En el campo de la parasitología, la tinción de Giemsa ha permitido hacer el diagnóstico de enfermedades parasitarias tales como la malaria, el mal de chagas y la leishmaniasis. En las dos primeras los parásitos Plasmodium sp y el Tripanosoma cruzi respectivamente pueden visualizarse en sangre periférica de los pacientes infectados, los mismos pueden encontrarse en diversos estadios según la fase en la que esté la enfermedad. Para mejorar la búsqueda de parásitos en sangre se recomienda usar la tinción de Giemsa mezclado con el colorante de May-Grünwald. Así mismo, la leishmaniasis cutánea puede diagnosticarse al evaluar muestras de biopsias de piel teñidas con Giemsa, donde se encuentra el parásito. Citología La tinción de Giemsa también es usada para el estudio citológico de muestras endocervicales, aunque no sea la técnica más frecuentemente usada para este fin. Pero en casos de escasez de recursos puede emplearse, teniendo una funcionabilidad similar a la que ofrece la técnica de Papanicolaou y a un menor costo. Sin embargo, requiere de experticia por parte del examinante.

Citogenética Una característica relevante de la tinción de Giemsa es su capacidad para unirse fuertemente a las regiones ricas en adeninas y timinas del ADN. Esto permite que el ADN pueda ser visualizado durante la mitosis de las células, en diferentes estados de condensación. Estos estudios son necesarios para detectar aberraciones cromáticas tales como duplicaciones, deleciones o translocaciones de las distintas regiones de los cromosomas. Investigaciones que demuestran la eficacia de la tinción de Giemsa Cannova y cols (2016), compararon 3 técnicas de coloración para el diagnóstico de leishmaniasis cutánea. Para ello, utilizaron muestras obtenidas de un animal de experimentación (Mesocrisetus auratus) inoculado experimentalmente con Leishmanias. Los autores demostraron que la tinción de Giemsa fue mejor que la coloración de Pap-mart® y Gaffney. Por tanto, consideraron que la coloración de Giemsa es la ideal para diagnosticar la leishmaniasis cutánea. Los excelentes resultados obtenidos por los autores se deben a que la combinación de colorantes que componen la mezcla de Giemsa presenta las condiciones necesarias para crear un contraste favorable, permitiendo distinguir claramente las estructuras de los amastigotas, tanto intra como extracelularmente. Las otras técnicas (Pap-mart® y Gaffney) también lo hicieron, pero de una forma más débil y por tanto más difícil de visualizar. Es por ello que la coloración de Giemsa se recomienda para el diagnóstico parasitológico de leishmaniasis. Así mismo, un estudio de Ramírez y cols (1994), evaluó la validez de las tinciones de Giemsa y Lendrum en frotis conjuntivales para la identificación de Chlamydia trachomatis. Los autores determinaron que la tinción de Giemsa y Ledrum poseen igual especificidad, pero Giemsa resultó ser más sensible. Esto explica porqué en la actualidad la tinción de Giemsa es la más frecuentemente utilizada para el diagnóstico de infecciones por clamidias, especialmente si existen pocos recursos.

Recomendaciones para una buena tinción No debe acelerarse el secado de las láminas. Se debe esperar el tiempo prudencial para el secado de la misma al aire libre. Aproximadamente 2 horas. Colorear inmediatamente pasadas las 2 horas para mejores resultados. Para que los frotis se fijen y se tiñan mejor la muestra debe ser distribuida sobre la lámina de tal manera que quede una capa delgada y uniforme.

La muestra de sangre preferida es la capilar, ya que el frotis se hace de manera directa de la gota de sangre y por tanto la muestra no lleva aditivo alguno, lo cual favorece el mantenimiento de las estructuras celulares. Sin embargo, si se usa sangre venosa se debe usar EDTA como anticoagulante y no heparina, ya que este último por lo general deforma las células. Errores comunes en la coloración de Giemsa En la práctica de esta coloración se pueden cometer errores. Los mismos se evidencian por cambios bruscos en las tonalidades de las estructuras. Coloración extremadamente azul Se puede deber a:    

Frotis muy gruesos Exceder en el tiempo de tinción Lavar de forma insuficiente. Uso de reactivos muy por encima del pH neutro (alcalino).

Bajo estas condiciones los colores de las siguientes estructuras se distorsionan, de tal manera que los eritrocitos en vez de teñirse de rosa-salmón se verán verdes, los gránulos de los eosinófilos que deben teñirse de rojo ladrillo se tornarán azulados o grises y así sucesivamente habrá desviación en las tonalidades habituales. Coloración excesivamente rosada Puede deberse a:    

Tiempo de tinción insuficiente. Lavado prolongado o excesivo. Mal secado. Empleo de reactivos muy ácidos.

En este caso en particular, las estructuras que normalmente se tiñen de azul no serán casi visibles, mientras que las estructuras que se tiñen de rosa tendrán tonalidades muy exageradas. Ejemplo: los eritrocitos tomarán un color rojo brillante o anaranjado fuerte, la cromatina nuclear se verá rosa pálida y los gránulos de los eosinófilos se teñirán de rojo brillante intenso.

Presencia de precipitados en el frotis Las causas pueden ser:     

Usar láminas sucias o mal lavadas. No dejar secar bien el frotis. Dejar la solución fijadora por demasiado tiempo. Lavados inadecuados al concluir la tinción. Filtración inadecuada o no filtración del colorante que se está utilizando.

Presencia de artefactos morfológicos En los frotis pueden aparecer artefactos morfológicos que dificultan la visualización e interpretación de las estructuras presentes. Esto se debe a:  

Tipo de anticoagulante empleado, como la heparina. Uso de láminas sucias, deterioradas o grasientas.

Modo de almacenamiento Después de preparado el colorante debe mantenerse a temperatura ambiente (15 – 25°C), para evitar que el colorante precipite. Debe almacenarse en envase ámbar bien cerrado. Referencias 1. Cannova D, Brito E y Simons M. Evaluación de técnicas de coloraciones para el diagnóstico de la Leishmaniasis cutánea. Salus. 2016; 20 (2): 24-29. 2. PanReac Applichem ITW Reagents. Tinción de Giemsa. Versión 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, España. 3. Clark G. Staining procedures (1981), 4thed. Williams & Willkins. 4. Química Clínica Aplicada. Colorante Giemsa para diagnóstico in vitro. Distribuidor: cromakit.es 5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F y Grazioso C. Validez de las tinciones de Giemsa y Lendrum en frotis conjuntivales para la identificación de Chlamydia trachomatis. Bol of Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212-216. 6. Casas-Rincón G. Micología General. 1994. 2° Ed. Universidad Central de Venezuela, Ediciones de biblioteca. Venezuela, Caracas. 7. «Tinción de Giemsa.» Wikipedia, La enciclopedia libre. 1 Sep 2017, 01:02 UTC. 6 dic 2018, es.wikipedia.org.

TINCIÓN DE MAY GRÜNWALD-GIEMSA

La tinción de May Grünwald-Giemsa o Pappenheim es una técnica de coloración diferencial que mezcla los reactivos Giemsa y May Grünwald. Es utilizada para la diferenciación de células sanguíneas normales y anormales en frotis de sangre periférica y médula ósea, así como para la tinción de cortes histológicos y muestras citológicas. Ambos reactivos —Giemsa y May Grünwald— se derivan de la tinción tipo Romanowsky, técnica que está basada en la combinación de colorantes ácidos y básicos. Frotis donde se muestra un segmentado neutrófilo y un mileocito en un caso de Leucemia Mieloide Crónica, teñido con la tinción de May Grünwald Giemsa. Dr Ramon Simon-Lopez (https://es.m.wikipedia.org/wiki/Archivo:LMC-1.JPG) a través de Wikipedia.org. Giemsa mejoró la técnica al estabilizar la mezcla de eosina, azul de metileno y sus derivados, con glicerol. En cambio, May Grünwald utiliza eosina y azul de metileno, usando como solvente el metanol. Esta combinación estratégica ha dado excelentes resultados.

Si bien en cuanto a la observación de morfología celular actúa de forma similar a las coloraciones de Giemsa y Wright, esta técnica mejora las anteriores afinando la coloración de los parásitos que causan el paludismo, el mal de Chagas, la leishmaniasis y la tricomoniasis. Adicionalmente, ha mostrado ser una técnica muy útil para el estudio citológico del líquido espermático. Se ha destacado no solamente al mostrar las características morfológicas de los espermatozoides, sino que además permite diferenciar con gran eficacia los leucocitos, las células epiteliales y las células de la espermatogénesis. Fundamento La técnica sigue el fundamento de las tinciones de Romanowsky, en las que los colorantes ácidos tienen afinidad selectiva por los componentes básicos celulares y los componentes ácidos atraen a los colorantes básicos. Explicado de otra forma, tanto las estructuras celulares como los colorantes poseen cargas eléctricas positivas o negativas; las cargas iguales se repelen y las cargas diferentes se atraen. Por ejemplo, los colorantes básicos como el azul de metileno están cargados positivamente y son atraídos por las estructuras cargadas negativamente. Es por ello que este colorante tiñe los núcleos que son ricos en ADN y ARN que poseen grupos fosfatos cargados negativamente. También se tiñen los gránulos de los segmentados basófilos y los citoplasmas de los glóbulos blancos mononucleares que contienen ARN. Así mismo, el colorante ácido lleva carga negativa, por lo que se une a estructuras cargadas positivamente como los eritrocitos y los gránulos de los segmentados eosinófilos. En cuanto a los gránulos de los segmentados neutrófilos, estos fijan ambos colorantes. Variedad de colorantes En esta técnica coexiste una combinación de reacciones entre los colorantes ortocromáticos y los metacromáticos. Los ortocromáticos (la eosina y el azul de metileno) se fijan a la estructura celular a la que son afines y proporcionan un color estable que no varía. En cambio, los metacromáticos (los derivados del azul de metileno azure A y azure B), varían su color original una vez unidos a la estructura específica, pudiendo incluso haber variedad de matices. Finalmente, el paso que lleva la solución May Grünwald necesita la presencia de agua, pues sin este el colorante penetrará las estructuras pero no se fijará. Para que ello ocurra el colorante debe volverse polar o ionizarse, y así ser capaz de precipitar y fijarse a las estructuras afines.

Técnica Materiales – Láminas portaobjetos. – Puentes de coloración. – Solución de May-Grünwald. – Tinción de Giemsa. – Agua destilada. Solución concentrada de colorante May Grünwald Se deben pesar 0,25 gr de eosina-azul de metileno (colorante según May Grünwald) y disolver en 100 ml de metanol. Luego se mezcla la preparación durante 1 hora y se deja reposar por 24 horas. Finalizado el tiempo, se filtra. Para aplicar la técnica debe diluirse el colorante May Grünwald de la siguiente manera: para 200 ml de colorante diluido se miden 30 ml de la solución concentrada, se agregan 20 ml de solución tampón y 150 ml de agua destilada ajustada a pH7.2-7.3. Posteriormente se mezcla y se filtra. Colorante de Giemsa concentrado Se deben pesar 0,5 gr de azur-eosina-azul de metileno (colorante según Giemsa), disolver en 50 ml de metanol y colocar a la mezcla 50 ml de glicerina. Para ejecutar la técnica se diluye 1:10 con solución tampón y se deja reposar por 10 minutos. Se puede filtrar si es necesario. Preparación de la solución tampón a pH 7,2 Deben pesarse: – 40 mg de potasio di-hidrógeno fosfato (KH2PO4). – 151 mg de di-sodio hidrógeno fosfato 12-hidrato (Na2HPO4).

Se disuelven ambos compuestos en 100 ml de agua. Procedimiento de tinción de frotis sanguíneos o de médula ósea Existen dos modalidades: una clásica y una rápida. Modalidad clásica 1. Cubrir los frotis durante 2 o 3 minutos con la solución de May-Grünwald diluida. 2. Lavar con agua destilada tamponada para eliminar la solución anterior. 3. Cubrir con la misma solución de lavado tamponada y dejar por 1 minuto. La idea es que el colorante anterior se fije a las estructuras y que, al mismo tiempo, se hidraten las células. 4. Agregar 12 gotas de tintura de Giemsa diluida sobre el agua tamponada y soplar para mezclar y homogeneizar. Dejar reposar durante 15 o 20 minutos. 5. Lavar los frotis con agua destilada tamponada y...