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MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL

GRUPO: 1

EQUIPO :1

Informe de práctica 6. Tinciones. OBJETIVOS. Conocer los diferentes tipos de tinciones, tinciones diferenciales (Tinción de Gram, tinción de Ziehl- Neelsen) y tinciones selectivas( tinción negativa o de cápsula y tinción de esporas) ,para poder visualizar estructuras tanto generales y específicas de acuerdo a diferentes microorganismos , así mismo aplicar correctamente la técnica de manejo de cada una de ellas, ya que con una buena y correcta manipulación del microscopio se obtiene un mejor vire y se obtendrán los resultados esperados según lo que establezca la literatura sobre la morfología de cada microorganismo. RESULTADOS. Antes de emplear cualquier tipo de tinción se realizó la fijación de cada microorganismo con ayuda de la flama para que permaneciera inmóvil,( excepto con las tinciones de capsula ya que este paso secaría la cápsula y no permitirá su correcta observación), a esta acción se le conoce como “Frotis fijo”. Descripción de la muestra observada

Tinción simple:

Tinción de Gram:

Tinciones Selectivas (Espora y cápsula)

Tinción de Ziehl- Neelsen

TINCIÓN DE GRAM En la tinción de Gram se observa un cambio en la coloración sobre diferentes microorganismos, este cambio se debe a la diferencia en la estructura de la pared celular de cada microorganismos, clasificándolos en células grampositivas y gramnegativas (Brock, 2009). La diferenciación de estas tinciones se debe a que las grampositivas tienen ácidos teicoicos y peptidoglicano en mayor proporción (>50%) en comparación con las gramnegativas (10-20%) (Brock,2009). En las grampositivas el decolorante al ser un disolvente higroscópico deshidrata la pared disminuyendo su permeabilidad por lo que al tratarse con alcohol/acetona no pierde el complejo cristal violeta-I2, siendo este paso del decolorante un punto clave para tinción de Gram. Por otra parte, las gramnegativas tienen una membrana externa constituida por lipopolisacáridos y lipoproteínas, el decolorante al ser un disolvente orgánico disuelve la bicapa lipídica de la membrana externa, por lo que facilita la salida del complejo I2-cristal violeta quedando incoloras.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS.

Donde al final al agregar safranina (colorante básico) las gram negativas se tiñen de color rojo y las gram positivas quedan de color violeta, observándose así la muestra de Moraxella sp . (infecciones respiratorias) y E  scherichia coli ( dolores estomacales) de color rosa por lo tanto se interpretan como bacilos cortos de tipo gram (-) las cuales fueron evidenciadas por la safranina y por otra parte las muestras de Bacillus subtilis (intoxicaciones alimenticias), S. aureus (infección en la piel) y Mycobacterium (tuberculosis) se muestran al microscopio de color violetas evidenciándose como microorganismos de tipo gram (+). Cabe recalcar que fueron

observadas a 100x teniendo un aumento total de 1000 aumentos para una mejor visualización y que es importante para esta tinción tener un colorante primario y uno de contraste. TINCIÓN DE ZIEHL NEELSEN Para la tinción de las ácido-alcohol resistentes (BAAR) se empleó un colorante básico como es fucsina fenicada . La fucsina fenicada entra a las células mediante el calentamiento del portaobjetos con el frotis celular, observándose dos tipos de bacterias AAR y NAAR, las AAR se diferencian de la NAAR debido a que las AAR presentan ácidos micólicos como en el caso de las micobacterias en su pared celular y otros lípidos los cuales no permiten el paso de los colorantes; por esta razón se calienta el frotis para que las estructuras cerosas se reblandezcan y permitan el paso de la fucsina fenicada, la cual tiene una solubilidad relativamente mayor en los lípidos que el decolorante. Por está razón el alcohol en las AAR no lava al colorante primario por ello se encuentra unido con los ácidos micólicos, la pared celular de las No AAR al carecer de estos, el decolorante arrastra a la fucsina fenicada dejando a la célula incolora, entonces, al agregar el colorante de contraste o secundario (azul de metileno) la célula se tiñe de color azul. La micobacteria Mycobacterium sp . se cataloga como una bacteria de alcohol-ácido resistente la cual ha sido comprobada con el colorante fucsina y por otra parte el estafilococo S. aureus d  emostró según la literatura ser de tipo alcohol-ácido resistente la cual fue evidenciado por el azul de metileno tiñendo de color azul a los bacilos presentes de la muestra. TINCIÓN DE CÁPSULA Para la Tinción de cápsula se sabe que la cápsula es una cubierta extracelular que está presente en bacterias y levaduras. Su composición química mayoritariamente está compuesta por agua y polisacáridos como las dextranas y alginatos. (Lange,2005).

Las cápsulas y las capas mucilaginosas pueden ser gruesas o finas, rígidas o flexibles, dependiendo de su composición y su grado de hidratación. Si el material se organiza como una matriz gruesa que no deja penetrar pequeñas partículas, como la tinta china, se denomina cápsula. (Brock 2009) Este procedimiento consiste en la coloración del entorno con un colorante ácido, dejando a las células incoloras. El colorante negro de nigrosina (tinta china) se utiliza a menudo y con esta tinción logramos ver de manera precisa la cápsula de las bacterias presentes en el pulque tornándose de un tono aclarado en presencia del contraste negro que presentó la tinta china impidiendo la cápsula la penetración de este colorante y por ello se corroboro lo que la literatura fija en que es impenetrable y por ello se emplea este tipo de contraste para su visualización. TINCIÓN DE ENDOSPORAS Por último se llevó a cabo la Tinción de endosporas: Las endosporas son células diferenciadas, características por ser una forma de latencia del metabolismo microbiano , que son muy resistentes al calor,compuestos químicos y radiación, se observan como estructuras brillantes y refráctiles dentro de la célula (Brock 2009). Se caracterizan por presentar varias capas compuestas de proteínas y azúcares complejos (exosporio y cubiertas) , mientras que en el protoplasto o núcleo de la misma existe un complejo de ácido dipicolínico de calcio, debido a esta composición es muy difícil que los colorantes penetren por lo que en esta tinción se pudo observar las esporas de dos tipos de bacterias B. cereus (intoxicación de alimentos)y B. megaterium (a  gente de control biológico) p  ercatandonos de la presencia de esporas centrales y terminales teñidas de color verde debido al colorante verde de malaquita por otro lado las células vegetativas como tal se tiñeron de color rojo debido a la presencia de la

safranina al 0.5% ,esto se corrobora con la literatura explicada anteriormente.

CONCLUSIÓN. Las tinciones en Microbiología son una herramienta muy importante para el estudio de los microorganismos, pues contamos con diferentes tipos de tinciones para diferentes microorganismos y para diversas estructuras de interés para su estudio y observación, cabe recalcar que cada una conlleva un proceso diferente puesto que cada una de ellas varía según el tema de interés a estudiar, de su morfología, características particulares ya sea su movilidad, estructura microbiana y alguna agrupación en particular; su interpretación requiere de igual manera habilidad en el uso del microscopio ya que es una herramienta importante en su observación final, cabe señalar que algunas muestras no fueron las más claras esto se debe a que para algunas se aplicó en exceso algún colorante ( primario o secundario) lo cual para esos casos complicó un poco su asimilación , un detalle que igual consideramos peculiar ha sido el corto tiempo que se empleó para algunas de ellas ya sea debido a la gran lista de actividades planteadas para la clase pero en ninguna tinción se descuido el tiempo que debe tener cada paso para la fijación del colorante o del fuego indirecto caso para Ziehl Neelsen o endosporas.

BIBLIOGRAFÍA: Madigan, M., Bender, K., Buckley, D., & Stahl, D.(2015). BROCK. Biología de los microorganismos. Madrid: Pearson. Briseño, K. (2016). Tinción de Ziehl-Neelsen: Fundamento, Reactivos y

Técnica. Agosto 26,2019, de Lifeder Sitio web: https://www.lifeder.com/tincion-ziehl-neelsen / Pedroza, M. (2008). Caracterización microbiológica del pulque y cuantificación de su contenido de etanol mediante espectroscopia Raman . Agosto 26, 2019, de Sociedad Mexicana de Ciencia y Tecnología de Superficies y Materiales Sitio web: https://www.fis.cinvestav.mx/~smcsyv/supyv ac/21_1/SV2110108.pdf Jawetz, Melnick y Adelberg.Lange Microbiología médica, 2005,Mc Graw Hill....