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UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI MILANO CORSO DI LAUREA IN FARMACIA LABORATORIO DI ANALISI DEI MEDICINALI III LINEE GUIDA PER LO SVOLGIMENTO DELLE PROVE PRATICHE: RICONOSCIMENTO DI FARMACI ISCRITTI ALLA FARMACOPEA EUROPEA (E. V Ed.) A cura di: Prof Marina Carini Dr. Giancarlo Aldini Istituto Chimico Farma...

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UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI MILANO CORSO DI LAUREA IN FARMACIA

LABORATORIO DI ANALISI DEI MEDICINALI III

LINEE GUIDA PER LO SVOLGIMENTO DELLE PROVE PRATICHE: RICONOSCIMENTO DI FARMACI ISCRITTI ALLA FARMACOPEA EUROPEA (E.P. V Ed.)

A cura di: Prof.ssa Marina Carini Dr. Giancarlo Aldini Istituto Chimico Farmaceutico Tossicologico

INDICE SCHEMA GENERALE DI ANALISI …………………………………………………… pag. 3 SAGGIO DELLA COMBUSTIONE: DISTINZIONE SOSTANZE ORGANICHE, METALLORGANICHE, INORGANICHE …………………………………….………... pag. 5 RICONOSCIMENTO DI SOSTANZE ORGANICHE ……………………...…………… Analisi elementare …………………………………………………………………….. A) Ricerca di azoto e zolfo - Saggio di Lassaigne ..……………………………… B) Ricerca di alogeni ………………………………………………………….…... C) Ricerca del fosforo …………………………………………………………….. Studio della solubilità …………………………………………………………………. Solubilità secondo E.P. IV Ed. ………………………………………………………... Riconoscimento dei gruppi funzionali e reazioni specifiche ………………………… Aromaticità ………………………………………………………………………… Doppio legame olefinico …………………………………………………………... Fenoli ……………………………………………………………………………….. Zuccheri (gruppo carbonilico) ……………………………………………………. Reazione di Lieben (aloformica) ………………………………………………….. Ammine ……………………………………………………………………………. Nitroderivati aromatici …………………………………………………………… Sulfamidici …………………………………………………………………………. Alcaloidi ……………………………………………………………………………. Determinazione del punto di fusione ………………………………………………….

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RICONOSCIMENTO DI SOSTANZE INORGANICHE ……………………………….. Solubilità……………………………………………………………………………….. Analisi di sostanze inorganiche solubili in acqua o acidi minerali ……………….…. 1) Misura del pH …………………………………………………………………... 2) Reazioni di identificazione dei cationi secondo metodo periodale …………... 3) Reazioni di identificazione degli anioni ……………………………………….. Analisi di sostanze inorganiche insolubili in acqua o acidi minerali………………….

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RICONOSCIMENTO DI SOSTANZE METALLORGANICHE………………………… pag. 41

Elenco delle sostanze organiche suddivise per composizione elementare • Contenenti C, H, O…………………………………………………………………. • Contenenti C, H, O, Cl……………………………………………………………... • Contenenti C, H, O, N ……………………………………………………….…….. • Contenenti C, H, O, N, Cl…………………………………………………….……. • Contenenti C, H, O, N, S……………………………………………………….…... • Contenenti C, H, O, N, S, Cl………………………………………………………..

pag. pag. pag. pag. pag. pag.

Elenco delle sostanze metallorganiche suddivise per metallo-ione …………………….

pag. 53

Elenco delle sostanze inorganiche ………………………………………………………..

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SCHEMA GENERALE DI ANALISI Le sostanze iscritte in European Pharmacopoeia IV Ed. (E.P.) che sono oggetto della prova pratica di “Riconoscimento e saggi di purezza” sono suddivisibili in tre classi: A) ORGANICHE B) INORGANICHE C) METALLORGANICHE La prima fase del riconoscimento consiste nello stabilire, mediante il Saggio della combustione (analisi al coccio) a quale delle tre classi appartiene la sostanza incognita. Sulla base della composizione determinata dal saggio della combustione, si procede con schemi di analisi diversificati per le tre classi di sostanze. SOSTANZA ORGANICA 1) analisi degli elementi (azoto, zolfo, cloro) 2) studio della solubilità e misura del pH: la solubilità consente di capire, una volta individuati gli elementi, a quale ulteriore sottoclasse la molecola appartiene. Esempio 1: supponiamo di aver identificato azoto e cloro; le sostanze che contengono questi elementi (Tabelle pag. 52-53) sono suddivise in due sottoclassi, denominate “cloro ionico” e “cloro non ionico”. Tutte le molecole appartenenti alla prima sottoclasse (in quanto sali di basi organiche) saranno caratterizzate da una spiccata solubilità in acqua; in questo caso si deve confermare, attraverso l’analisi qualitativa inorganica (pag. 39), che il cloro individuato per calcinazione è presente come cloridrato. Le molecole appartenenti alla seconda sottoclasse (cloramfenicolo e cloramfenicolo palmitato), in cui il cloro non è in forma di cloridrato, saranno invece totalmente insolubili in acqua. Esempio 2: Per le sostanze contenenti azoto e zolfo (Tabelle pag. 54-55) si evidenziano tre sottoclassi: a) solfati di basi: solubilità in acqua spiccata; b) sulfamidici: insolubili in acqua, ma solubili in NaOH e HCl; c) altre sostanze: solubilità diverse da quelle indicate per le prime due sottoclassi 3) determinazione del punto di fusione 4) consultazione degli elenchi delle sostanze organiche suddivise per composizione elementare e in ordine di punto di fusione: individuazione di una ristretta serie di sostanze contenenti gli elementi identificati 5) consultazione della E.P. per l’attribuzione della struttura della/e molecola/e individuata attraverso il punto di fusione 6) applicazione delle reazioni di riconoscimento dei gruppi funzionali e/o reazioni specifiche per la conferma strutturale o per differenziare fra molecole con punti di fusione molto simili (± 5°C rispetto al valore di p.f. determinato). SOSTANZA INORGANICA 1) valutazione della solubilità in acqua e acidi minerali diluiti. 2) Per le sostanze solubili in acqua o acidi minerali dil. si procede secondo l’analisi qualitativa, identificando dapprima il catione secondo il metodo periodale (pag. 35). • Si consulta la Tabella dei sali inorganici iscritti in E.P. (pag. 60) e si considerano solo le sostanze contenenti il catione identificato. • Si effettua la ricerca dell’anione secondo le modalità descritte a pag. Es. Se si è identificato come catione lo zinco, si effettua la ricerca degli anioni limitatamente agli ioni cloruro e solfato. 3) Per le sostanze insolubili in acqua e in acidi minerali si procede alle reazioni di identificazione riportate a pag. 45. 3

N.B. Alcune sostanze inorganiche sono sottoforma di ossidi (es. ZnO, MgO): su queste molecole pertanto risulteranno negativi tutti i saggi di riconoscimento degli anioni. Viceversa nel caso dell’acido borico H3BO3, risulteranno negativi i saggi di riconoscimento deii cationi SOSTANZA METALLORGANICA 1) Identificazione del catione, limitando la ricerca ai seguenti cationi che possono essere presenti nelle sostanze metallorganiche: BISMUTO, CALCIO, LITIO, MAGNESIO, POTASSIO, SODIO ZINCO. La ricerca del catione viene effettuata secondo le modalità descritte alla voce Riconoscimento di sostanze metallorganiche (pag. 46). 2) Consultazione dell’elenco completo delle sostanze metallorganiche (pag. 58) e studio della solubilità 3) Analisi della porzione organica: ricerca degli elementi presenti. 4) Identificazione finale della sostanza: applicazione delle reazioni di riconoscimento dei gruppi funzionali solo dopo aver individuato, attraverso le indagini ai punti 1-3, un numero limitato di possibili sostanze.

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SAGGIO DELLA COMBUSTIONE (DISTINZIONE SOSTANZE ORGANICHE, METALLORGANICHE, INORGANICHE) Le sostanze iscritte in E.P. sono suddivisibili in tre classi: A) ORGANICHE B) INORGANICHE. C) METALLORGANICHE Il saggio della combustione (Fig. 1) costituisce un valido criterio per differenziare le tre classi di composti, e comporta l’osservazione del comportamento della sostanza durante la combustione (odore, colore, sviluppo di fumi neri, sublimazione, fusione). In pratica si pone una piccola quantità di sostanza su di un coccio di porcellana, si riscalda alla fiamma ossidante di un bunsen e si osserva il comportamento della sostanza sotto l’effetto del riscaldamento, procedendo con la combustione fino a che il residuo non va incontro ad ulteriori modificazioni. A) Le sostanze organiche, per riscaldamento bruciano e carbonizzano o si decompongono senza bruciare, formando acqua, CO2, e altri prodotti volatili, senza lasciare sul coccio alcun residuo. Tuttavia diverse sostanze organiche, tra cui gli zuccheri e alcuni acidi organici, lasciano un residuo nero sottoforma di specchio lucente (Fig. 1a); in altri casi (es. sulfamidici) si può osservare un residuo di color grafite, lucente, con consistenza di cenere (Fig. 1b) (se posto in acqua galleggia Fig. 1c), da non confondere con il residuo lasciato dalle sostanze metallorganiche. B) Le sostanze inorganiche restano inalterate al riscaldamento, anche ad elevate temperature (Fig.1 d-f). C) Nelle sostanze metallorganiche brucia la porzione organica, e resta sul coccio un residuo costituito dal metallo sotto forma di ossido o carbonato. Ad es. il benzoato di sodio per combustione dà luogo a carbonato di sodio, il calcio lattato a calcio carbonato e calcio ossido, il potassio sorbato a carbonato di potassio. Il residuo, generalmente di colore scuro, è opaco, ed ha consistenza polverosa (Fig. 1g) e, se posto in acqua, si deposita sul fondo (Fig. 1h). Alcune particolarità nel comportamento al coccio possono contribuire ad identificare in via preliminare la sostanza. Nel caso delle sostanze organiche: • se la fiamma è gialla senza fumi si tratta di sostanze alifatiche; • se la fiamma è fuligginosa (sviluppo di fumi neri) si tratta di sostanze insature o aromatiche; • gli zuccheri (glucosio, fruttosio, lattosio, saccarosio) bruciano con caratteristico odore e colore di caramello; • acido ascorbico e acido tartarico presentano un comportamento al coccio simile a quello degli zuccheri; • tra le basi puriniche, la teofillina sublima, depositandosi sulle pinze sotto forma di fiocchetti bianchi, l’aminofillina dà questi fiocchetti se si passa rapidamente dal riscaldamento al raffreddamento, la caffeina può dare solo delle piccole formazioni bianche sulle pinze; • l’amido carbonizza con caratteristico odore di pane bruciato; • le sostanze organiche contenenti iodio sono sostanze colorate e sviluppano, per riscaldamento, vapori intensamente colorati di viola. Nel caso delle sostanze metallorganiche: • sali di calcio (calcio gluconato e calcio lattato): entrambi rigonfiano al coccio, il primo in misura maggiore; • sali di bismuto (bismuto salicilato): lasciano un residuo di ossido di bismuto colorato di gialloarancione. N.B. Anche i sali di bismuto inorganici si colorano di giallo arancio, ma in questo caso non si hanno ulteriori modificazioni (non si osserva combustione della porzione organica); • calcio e magnesio stearato fondono con caratteristico odore di candela. 5

Nel caso delle sostanze inorganiche: • alcune sostanze inorganiche contengono acqua di cristallizzazione (es. borace) e per riscaldamento si osserva perdita di acqua (Fig. 1e): si forma un residuo compatto, nella maggior parte dei casi BIANCO (Fig. 1f); • sodio tiosolfato: perde acqua di cristallizzazione e si decompone in anidride solforosa, dall’odore caratteristico, lasciando un residuo giallo-marrone compatto; • allume (alluminio potassio solfato): perde acqua di cristallizzazione, bolle e rigonfia sul coccio, lasciando un residuo compatto di colore bianco; • borace (sodio tetraborato decaidrato): perde acqua di cristallizzazione lasciando un residuo vetroso; • sali di ammonio: sublimano per riscaldamento, con formazione di vapori bianchi e odore di ammoniaca; non rimane alcun residuo; • sali di bismuto: la polvere si colora di arancio, senza subire ulteriori trasformazioni; • zinco ossido e titanio biossido: entrambi per riscaldamento assumono colorazione gialla, che scompare per raffreddamento. Entrambi sono insolubili in acqua: lo zinco ossido è solubile in acidi minerali concentrati; il titanio biossido è insolubile.

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RICONOSCIMENTO DI SOSTANZE ORGANICHE Analisi elementare (sostanze organiche e metallorganiche) A) Ricerca di azoto e zolfo - Saggio di Lassaigne Il saggio di Lassaigne consente di identificare la presenza in una molecola organica o metalloorganica di azoto e zolfo, anche quando questi elementi siano contemporaneamente presenti. Si basa sulla distruzione della sostanza organica ad elevata temperatura in presenza di sodio metallico: l'ambiente riducente provoca la liberazione dell'azoto organico sottoforma di CN- e dello zolfo sottoforma di S2-. Esecuzione pratica del saggio (Fig. 2): in un tubo da saggio viene introdotta la sostanza in esame e un pezzetto di sodio metallico (preventivamente asciugato da etere di petrolio su carta da filtro); si tiene l'imboccatura della provetta con le pinze e si scalda sulla fiamma ossidante (Fig. 2a) (sotto cappa) fino ad incandescenza dell'estremità inferiore del tubo (non meno di 7-8 minuti). Si immerge quindi il tubo, rompendolo, nel calice contenente 10-15 ml di acqua distillata (Fig. 2b). Si raffredda, si filtra (Fig. 2c), e sulla soluzione alcalina ottenuta si eseguono i saggi di riconoscimento per N e S. La soluzione deve essere limpida e incolore (Fig. 2d): se così non fosse occorre ripetere il saggio prolungando i tempi di riscaldamento (alla base di questo inconveniente è infatti l'insufficiente riscaldamento della sostanza con il sodio metallico, che determina incompleta distruzione della sostanza stessa e formazione di composti di condensazione colorati). Un'aliquota della soluzione alcalina ottenuta (circa 2 ml) viene addizionata con una punta di spatola di FeSO4. Si possono verificare 3 casi: -

Se sono contemporaneamente presenti azoto e zolfo (es. sulfamidici, atropina solfato, Fig. 3a), si ottiene istantaneamente un precipitato nero di FeS; sulla stessa soluzione contenente il precipitato nero di FeS si procede al riconoscimento dell'azoto: si acidifica con acido solforico diluito e si scalda a b.m. fino a completa dissoluzione del precipitato (si libera H2S, evidenziabile con una cartina imbevuta di piombo acetato posta all'imboccatura della provetta). Se è presente N, si ottiene una colorazione blu/azzurra, dovuta alla formazione del complesso blu di Prussia (ferrocianuro ferrico). N.B. L’intensità della colorazione varia dall’azzurro pallido al blu intenso in relazione al contenuto percentuale dell’azoto nella molecola. Nel caso di colorazione azzurro pallido, filtrare il campione e verificare la colorazione blu al centro del filtro (Fig. 3b).

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Se è presente solo zolfo (Fig. 3d), aggiungendo FeSO4 si ottiene il precipitato nero di FeS; acidificando con acido solforico dil. e scaldando a b.m. la soluzione torna limpida, e non si sviluppa alcuna colorazione blu. N.B. Non sono riportate in elenco sostanze organiche che contengano solo zolfo; fra le metalloorganiche il sodio laurilsolfato. N.B. Un metodo per confermare la presenza di zolfo consiste nel trattare un'aliquota della soluzione basica di Lassaigne con un cristallino di sodio nitroprussiato; in presenza di ioni S2- si ha istantaneamente formazione di una colorazione viola intensa (Fig. 3a). Na2S + Na2 [Fe(CN)5NO] ' Na4[Fe(CN)5NOS] viola

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Se è presente solo azoto (es. basi puriniche, Fig. 3c), l'aggiunta alla soluzione basica di Lassaigne di FeSO4 dà luogo alla formazione di ferrocianuro di sodio 2 NaCN + FeSO4 ' Fe(CN)2 + Na2SO4 Fe(CN)2 + 4 NaCN ' Na4[Fe(CN) 6] ferrocianuro di sodio; 7

la soluzione appare colorata di verde scuro (fiocchetti) per la formazione di Fe(OH)2, da non confondere con la colorazione nera del FeS. Scaldando la soluzione all'ebollizione per alcuni minuti si ha parziale ossidazione degli ioni ferrosi a ferrici ad opera dell'aria; acidificando con acido solforico dil. si sciolgono gli idrossidi di ferro e compare la colorazione del ferricianuro ferrico (Blu di Prussia): 2 Fe2 (SO4)3 + 3 Na[Fe(CN)6] ' Fe4[Fe(CN)6]3 + 6 Na2SO4 Se la ricerca dello zolfo ha dato risultato positivo, si deve accertare se tale elemento fa parte della molecola o è presente come ione SO42- (es. solfato di una base organica). In tale caso la molecola deve contenere anche azoto e deve essere solubile in H2O. Si procede quindi al riconoscimento degli ioni SO42- secondo l’analisi qualitativa inorganica (pag. 43). La molecola viene solubilizzata in HCl dil. e addizionata di BaCl2: si ottiene un precipitato bianco di BaSO4.

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B) Ricerca di alogeni (organici e inorganici) Si effettua una calcinazione della sostanza (Fig. 4) per liberare anche gli alogeni eventualmente legati covalentemente (in pratica la ricerca è limitata al cloro); con questo saggio non si distingue quindi tra alogeni organici (es. cloramfenicolo) e alogeni ionici (es. efedrina cloridrato, procaina cloridrato, etc.). In capsula di porcellana si calcina la sostanza con 3 parti di calcio ossido per circa 10 minuti (Fig. 4a), e si prosegue la calcinazione fino a che la massa non va incontro ad ulteriori modificazioni (Fig. 4b). Si raffredda, si riprende con acqua distillata (5-6 ml) e si filtra (Fig. 4c): in soluzione si ha il cloro sottoforma di ione Cl- per formazione di CaCl2 durante la calcinazione. I cloruri vengono quindi identificati secondo l'analisi qualitativa convenzionale: acidificazione con HNO3 dil., addizione di 5-6 gocce di AgNO3 e formazione di un precipitato bianco di AgCl (Fig. 4d) solubile in ammoniaca dil. Si raccomanda di eseguire la prova di solubilità in ammoniaca sul precipitato, dopo allontanamento del surnatante acido. Se la ricerca di cloro è risultata positiva, occorrerà procedere alla distinzione tra cloro organico e cloro ionico, ma solo se nella molecola è presente azoto o azoto/zolfo; se la molecola contiene infatti solo C,H,O, il cloro può essere esclusivamente di natura organica (es. cloralio idrato). La determinazione del cloro ionico (HNO3+AgNO3) deve essere effettuata sulla soluzione degli anioni, preparata secondo le modalità descritte a pag. 39. N.B. E’ sconsigliabile la ricerca del cloro ionico direttamente sulla sostanza solubilizzata in acqua, data la possibile formazione di precipitati interferenti all’aggiunta del reattivo (HNO3 dil. e AgNO3).

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C) Ricerca del fosforo Si calcina la sostanza (una punta di spatola) in capsula di porcellana (Fig. 5a) con un eccesso (4 parti) di miscela ossidante (miscela 1:1 di KNO3 e Na2CO3 già allestita) secondo le modalità operative descritte per gli alogeni. La sostanza viene decomposta e ossidata ed il fosforo è presente al termine della calcinazione (Fig. 5b) sottoforma di Na3PO4; dopo raffreddamento, si riprende la massa con HCl dil. (5-6 ml) e si filtra (Fig. 5c). Il filtrato viene suddiviso in due aliquote: a) un’aliquota viene trattata con 2 ml di miscela magnesiaca (MgCl2 + NH4OH): si scalda all’ebollizione e si alcalinizza con ammoniaca se necessario. Si ottiene un precipitato bianco di fosfato ammonico magnesiaco NH4MgPO4 (Fig. 5d). Il precipitato viene filtrato, raccolto sul filtro e lavato con acqua distillata (poche gocce onde evitarne la dissoluzione) fino a scomparsa dell'odore di ammoniaca (Fig. 5e); si addiziona al precipitato una goccia di AgNO3: il precipitato assume colorazione gialla intensa, per formazione di argento fosfato (Fig. 5f). NH4MgPO4 + 3 AgNO3 ' Ag3PO4

GIALLO

b) la seconda aliquota viene evaporata sul coccio (con cautela) fino a completa eliminazione della soluzione cloridrica. Dopo raffreddamento, il residuo (Fig. 5g) viene ripreso con 2 ml di HNO3 conc. (sotto cappa): si filtra e al filtrato si addizionano 2 ml di ammonio molibdato: si scalda a b.m. e per raffreddamento si ottiene un precipitato giallo di ammonio fosfomolibdato (NH4)3PO4 · 12MoO3 (Fig. 5h).

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Studio della solubilità (di sostanze organiche e metalloorganiche) La solubilità di una sostanza è strettamente dipendente dalle sue caratteristiche chimico-fisiche, in particolare dal tipo di forze intermolecolari e dal tipo di gruppi funzionali presenti. Pertanto, i dati di solubilità in acqua (e la relativa misura del pH), in solventi acquosi a diverso valore di pH ed in solventi organici di riferimento, identificano in genere la classe chimica a cui il composto appartiene. Solubilità in acqua L’acqua è un solvente polare ad elevata costante dielettrica, dotato di spiccato potere solvatante e pertanto molecole con gruppi funzionali altamente polari, in grado di fornire interazioni dipolo-dipolo e di contrarre legame idrogeno con le molecole di acqua, presentano elevata solubilità in acqua. Ind...