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Protocolo de antigungigrama ...

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ANTIFUNGIGRAMA

1. DEFINIÇÃO Técnica destinada à determinação da sensibilidade fúngica in vitro frente a agentes antifúngicos, também conhecido por Teste de Sensibilidade aos Antifúngicos (TSA). 2. INTRODUÇÃO As infecções fúngicas têm sido mais frequentes nos últimos anos, ocorrendo com maior gravidade em pacientes portadores de doenças de base que comprometem o sistema imune e que apresentam outros fatores de risco. Os testes de susceptibilidade a drogas antifúngicas vêm se tornando cada vez mais importantes, devido ao aumento das infecções fúngicas e à emergência da resistência a essas drogas. Observa-se nos últimos anos uma mudança no espectro das etiologias fúngicas, atribuída principalmente ao aumento de hospedeiros imunocomprometidos e ao longo uso de terapias antifúngicas profilática e empírica. A evolução da resistência fúngica pode ser avaliada pelo teste de susceptibilidade a antifúngicos. Diversos protocolos existem, no entanto, os mais utilizados são a micro diluição em caldo (MDC), disco-difusão (DD) e E-test. Geralmente, a MDC é um teste trabalhoso e que não é realizado, pois exige pessoal treinado, e o E-test é caro para ser aplicado na rotina laboratorial. A alternativa é o DD, pois é uma técnica simples, barata e reprodutível, que pode ser utilizada em laboratórios clínicos. A metodologia de disco-difusão em ágar para a avaliação da sensibilidade de cepas de fúngicas fornece um resultado quantitativo (halo de inibição) e um resultado qualitativo (sensível ou resistente). 3. FATORES DETERMINANTES PARA REALIZAÇÃO DO TSA:     

Material clínico – cuidado no isolamento de microbiota normal de determinado sítio anatômico, pois não é indicada a realização do TSA neste tipo de amostra; Realização da técnica – verificar se todos os passos estão sendo seguidos rigorosamente conforme prescrito; Escolha dos antimicrobianos – a escolha dos antimicrobianos deve ser adequado a realidade da instituição ou hospital; Pesquisa e confirmação de mecanismos de resistência. Atualização das recomendações dos grupos de antimicrobianos para cada grupo de micro-organismo e de seus halos de interpretação conforme indicado nas atualizações anuais das organizações internacionais (CLSI ou EUCAST). No Brasil a ANVISA padroniza a utilização do CLSI para os laboratórios.

4. AMOSTRAS  Tipo de amostra - Colônias provenientes de cultura fúngicas, isoladas a partir de meios de cultura não seletivos.  Armazenamento e estabilidade - As amostras devem ser armazenadas em incubadora a 32º C, por um período de 2-5 dias e observar seu crescimento (dependendo da espécie fúngica). As colônias a serem analisadas devem ser purificadas, afim de evitar erros na análise.  Critério para rejeição - As amostras que já ultrapassaram o prazo máximo de estabilidade devem ser rejeitadas para a análise, devendo ser repicadas em meio apropriado, e usadas colônias recentes. Outro cuidado importante consiste em verificar a pureza do inóculo, e na dúvida, sugere-se o repique da cepa. Em caso de contaminação, deve-se reisolar o micro-organismo a ser testado para evitar erros na medição dos halos. 5. MATERIAIS         

Estufa bacteriológica; Alças bacteriológicas em platina; Agar Mueller Hinton em placas (90X15mm ou 140x15 mm); Tubo com escala 0,5 Mac Farland ou tubidímetro; Solução salina estéril (NaCl 0,85%); Swabs estéreis para espalhamento da suspensão; Tabelas com os valores esperados de halos inibitórios; Bico de Bunsen; Reagentes (discos de papel impregnados com antifúngico).

6. Preparação do meio (Mueller-Hinton ágar) Inicialmente pesa-se a quantidade adequada de Mueller-Hilton (proporção de 36g para 1 litro de água destilada), que posteriormente deve ser dissolvida em um volume X de água destilada, utilizando-se um Erlenmeyer para a preparação do meio. Depois, o Erlenmeyer, contendo a solução, deve ser aquecido até que o meio fique límpido. O meio então deve ser auto clavado e ser vertido nas placas de Petri devidamente esterilizadas. Aguarda-se a solidificação do meio nas placas para poderem ser utilizadas. OBS: O protocolo M44-A, da Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), utiliza o meio suplementado com Glicose 2% e 0,5 mg/mL de azul de metileno. A glicose promove um crescimento mais rápido das culturas inoculadas e o azul de metileno permite melhor definição dos halos de inibição. Para realizar a preparação do meio Mueller-Hilton suplementado, deve-se apenas adicionar o azul de metileno no meio após o processo de autoclave e antes de verte-lo nas placas.

7. PRINCÍPIO DA TÉCNICA O procedimento consiste no preparo de uma suspensão de leveduras de cultivo recente, inoculação desta suspensão na superfície de uma placa de Agar Mueller Hinton, e adição dos discos de papel impregnados com antifúngicos de forma equivalente. Após a incubação em estufa, é analisado o padrão de crescimento ou inibição ao redor de cada disco, sendo então medido o tamanho de cada halo e o resultado pesquisado em tabelas apropriadas segundo a espécie fúngica em análise.

8. PROCEDIMENTO TÉCNICO Retirar as placas e os frascos com os discos da geladeira cerca de 20-30 minutos para que adquiram a temperatura ambiente antes da execução da prova. a) Com uma alça bacteriológica em platina devidamente flambada e resfriada, tocar na colônia recente (18-24h); b) Suspender as colônias em solução salina estéril (NaCl 0,85%) até se obter uma turvação compatível com o grau 0,5 da escala Mac Farland (1x106 UFC/mL). Para este passo deve ser utilizado um tubo aferido na escala 0,5 de Mac Farland como comparativo ou um turbidímetro. c) Embeber um swab estéril na suspensão, comprimindo-o contra as paredes do tubo para tirar o excesso da suspensão, e semear em seguida de forma suave em todas direções na placa (cinco direções), procurando abranger toda a superfície; d) Aguardar (não mais que 15 minutos) a superfície do ágar secar; e) Com auxílio de uma pinça flambada e resfriada, colocar os monodiscos ou multidiscos, de forma equidistante, sobre a superfície do meio inoculado, exercendo uma leve pressão com a ponta da pinça para uma boa adesão dos discos; f) Incubar a placa com os discos em estufa a 37 ºC por 48 horas; g) Resultados: Com o auxílio de uma régua, paquímetro ou dispositivo semelhante, medir o diâmetro dos halos inibitórios de cada disco, e consultar uma tabela apropriada para determinar se o fungo em análise é sensível, intermediário ou resistente ao antifúngico testado.

9. PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS  

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Seguir padronização técnica para execução da prova (CLSI, 2011); As placas devem ter espessura média de 4 mm não podendo ser inferiores a 3 mm ou superiores a 5 mm (respectivamente provocam resultados falsamente aumentados ou diminuídos); Inóculos mais carregados (acima do padrão 0,5 da escala Mac Farland) fornecem resultados falsamente diminuídos e inóculos mais fracos resultados falsamente aumentados; A pré-incubação da placa em estufa por 5 minutos após a inoculação com o swab é importante para remover o excesso de umidade, que pode causar a difusão errática do antifúngico após a implantação dos discos; Aguardar para que os materiais atinjam a temperatura ambiente no momento do uso; A temperatura de incubação deve ser rigorosamente controlada; Para as placas com tamanho 90x15 mm recomenda-se a colocação de no máximo 5 discos, já para a placa com 140x15 mm podem ser colocados até 12 discos. Esta sugestão visa impedir que o contato entre os antimicrobianos difundidos no meio, podendo fornecer distorções ligadas a sinergismo ou outros tipos de interação.

REFERÊNCIAS CONSULTADAS Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Methods for antifungal disk diffusion susceptibility testing of yeasts; approved standard M44-A2. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, 2009. MENEZES, Everardo Albuquerque; BARBOSA, Alana Cláudia Lima; CUNHA, Maria da Conceição dos Santos Oliveira; MENDES, Luana Guabiraba; CUNHA, Francisco Afrânio. Suscetibilidade a antifúngicos e fatores de virulência de Candida spp. isoladas em Russas, Ceará. Revista Brasileira de Análises Clinicas, [s. l.], 2016. MENEZES, Everardo Albuquerque; BARBOSA, Alana Cláudia Lima; CUNHA, Maria da Conceição dos Santos Oliveira; MENDES, Luana Guabiraba; CUNHA, Francisco Afrânio. Teste de sensibilidade de Candida albicans pelo método de disco-difusão: uma comparação de meios de cultura. Revista Brasileira de Análises Clinicas, Rio de Janeiro, v. 48, ed. 1, 29 jan. 2016. SETOR TÉCNICO DA LABORCLIN. Manual para antibiograma - difusão em disco. 5. ed. Pinhais: Labclin, 2011....