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APP2 La actividad celular de Cerebellar Purkinje modula el comportamiento agresivo Introducción: Las células de Purkinje son un conjunto de neuronas situadas en la corteza del cerebelo, descubiertas en 1837 por el fisiólogo checo Jan Evangelista Purkynje. Tradicionalmente se ha venido asociando el cerebelo al equilibrio y a la función motora del organismo y de hecho, se ha comprobado que en la mayor parte de los casos una patología en las células de Purkinje conlleva síntomas que incluyen ataxia, falta de reflejos o inhabilidad general para determinar el espacio y la distancia. Sin embargo, el estudio planeado viene a corroborar que a pesar de la asociación anterior, también la actividad celular de Purkinje puede estar asociada a comportamientos conductuales específicos de seres animales, como la regulación de comportamientos agresivos y violentos. El trabajo propuesto es un claro ejemplo de los condicionantes inmediatos de la conducta estudiados por la Psicología Fisiológica, dado que, mediante la intervención sobre una parte del SN, trata de comprobar las bases biológicas de patrones conductuales, intentando explicar los cambios en el organismo durante la determinación de una conducta. ¿A qué disciplina de la Psicobiología pertenece el trabajo? Psicología fisiológica, este estudio se enmarca dentro de la psicología fisiológica, que es una subdivisión de la neurociencia conductual que estudia los mecanismos neuronales de percepción y comportamiento a través de la manipulación directa del cerebro de sujetos animales no humanos en experimentos controlados. Concretamente, en este experimento, Se estudia los efectos de cambios en la actividad de las células de por 15 en el vermis posterior del cerebelo en la agresividad y otros comportamientos individuales. La neurociencia y la psicología fisiológica están íntimamente relacionadas. El objeto tradicional de estudio de la primera es la morfología y el funcionamiento del sistema nervioso. Por su parte, el objeto de estudio de la psicología fisiológica es la conducta. ¿Qué área cerebral se estudia y por qué? El cerebelo que es la segunda estructura más voluminosa encerrada en la caja craneana. Presenta dos estructuras laterales, los hemisferios cerebelosos que están unidos en el centro por una estructura alargada llamada el vermis (en la que se basa el artículo). Y finalmente las células Purkinje que usando métodos optogéneticos para modular la actividad de dichas células se evalúa el impacto sobre la agresión, en este caso en ratones. La capa de las células Purkinje se ubica bajo la molecular y contiene los somas de las células de Purkinje. Sus dentritas van a la capa molecular y sus axones descienden a la substancia blanca. Se estudia esta área cerebral porque siempre se ha asociado dicha zona con el equilibrio y la función motora, pero también desempeña funciones más amplias en los comportamientos afectivos y cognitivos y pretenden demostrar que el vermis cerebeloso puede regular el comportamiento agresivo. ¿Cuál es la hipótesis del trabajo?

La hipótesis a comprobar es: la actividad de las células Purkunje en el vermis cerebeloso regula la agresión y respaldan la importancia del cerebelo en la conducción de conductas afectivas que podrían contribuir a los trastornos neurológicos. ¿Qué objetivos principales se plantean los autores?   

Demostrar que el cerebelo no solo desempeña funciones de equilibrio y motoras sino también funciones más amplias como los comportamientos afectivos y cognitivos (memoria de trabajo, lenguaje, emoción, funciones ejecutivas…) Comprobar la relación entre la actividad de las células de Purkinje en el vermis cerebeloso y la regulación de las agresiones. Demostrar la importancia del cerebelo en la conducción de conductas afectivas que podrían contribuir a los trastornos neurológicos. Tipología de investigación:

Se trata de un ejemplo de intervención somática, puesto que la conducta actúa como variable dependiente (VD) y el organismo (el cerebelo) como variable independiente (VI), es decir, se manipula parte del SN (células de Purkinje) y se evalúa su repercusión en los cambios conductuales del sujeto. Según los autores, ¿por qué es interesante realizar los experimentos que plantean? Dichos experimentos podrían proporcionar muchos avances en los tratamientos cínicos ya que cada vez es más importante comprender qué áreas del cerebelo controlar las conductas no motoras, ayudando a regular las conductas agresivas y a mejorar múltiples trastornos neurológicos. A nivel general algunos estudios que he encontrado en internet uno de la Universidad Complutense Madrid concluye que una teoría unificadora de toda la función cerebral está aún muy lejana, pero algunos principios organizadores van estando más claros. Otros concluyen que otros estudios indican claramente que el cerebelo está involucrado en funciones autonómicas, así como en aspectos no relacionados con el movimiento, posiblemente en procesos cognitivos y emocionales, de lo cual se sabe muy poco todavía. Seguramente, nuevas aproximaciones experimentales que acompañarán al advenimiento de las neurociencias modernas revelarán datos interesantes que nos acercarán, cada vez más, al entendimiento de la función cerebelar en los mecanismos de aprendizaje motores, así como en aspectos cognitivos y emocionales de la conducta. Estudios anteriores Los estudios sobre la relación entre la actividad de las células de Purkinje y los aspectos conductuales son relativamente recientes. En 2018 un interesante estudio publicado por la Universidad de Medicina de Harvard (Molecular Psychiatry) defendió que una disfunción de las células de Purkinje podría mediar en la aparición del Trastorno del Especto Autista (TEA). Se ha demostrado que muchos pacientes con autismo presentan un nivel muy bajo de este tipo de neuronas. Esta afirmación vendría a corroborar el artículo presentado unos años antes, en 2014, por el Departamento de Neurobiología de la Universidad de Chicago en la revista Nature Communications, que, a través de la experimentación en ratones, defendió la idea de que una alteración en la capacidad de las células de Purkinje

conllevaba la dificultad para ayudar no sólo a la motricidad, sino también al correcto aprendizaje motor. En España, investigadores del Instituto de Neurociencias de Castilla y León (INCYL) de la Universidad de Salamanca publicaron igualmente en 2018 un estudio en la prestigiosa revista Scientific Reports, del grupo Nature, demostrando, a través nuevamente de la experimentación en ratones, que el deterioro de las funciones cognitivas y afectivas ocurre de forma progresiva cuando se daña el citoesqueleto de las células de Purkinje.

Parte II: Materiales, Métodos y Resultados

OPTOGENÉTICA ¿Qué tipo de intervención o intervenciones utiliza? Con respecto a la optogenética, en este estudio las intervenciones que se utilizan son la implantación de fibras y estimulación in vivo. Para ello y, en resumen, se fijó una fibra óptica multimodo en casquillos de cerámica. Para determinar la intensidad de luz que sale de las fibras, se midió la salida de las fibras con un medidor de potencia. Se utilizó un fotodiodo para medir la intensidad relativa durante destellos cortos y controlados por el disparador analógico del láser, y este valor se utilizó para calcular la potencia de salida durante los mismos. La intensidad de la luz suministrada in vivo se calculó dividiendo la salida de luz total por el área de superficie de la fibra óptica. Para evitar la desensibilización de ChR2 y la conducción de los PC hacia el bloqueo inducido por la despolarización, estimulamos a los animales que expresaban ChR2 mediante trenes flash de pulsos de 1 a 2 ms. Los ratones adultos fueron anestesiados con ketamina / xilazina suplementada con isoflurano. Se realizó una incisión para exponer el cráneo y se despegó suavemente el tejido conectivo y la musculatura por encima del cerebelo. Las coordenadas estereotáxicas utilizadas para apuntar implantes al vermis posterior y Crus II se determinaron inicialmente realizando craneotomías de prueba e inyectando pequeños volúmenes de colorante fluorescente o vectores de expresión viral. Se sacrificaron los animales y se utilizó una microcopia de fluorescencia post hoc para determinar la ubicación de las craneotomías en relación con la superficie del cerebelo. Para los implantes vermales, el sitio de la craneotomía se determinó usando una pipeta fina unida a un dispositivo estereotáxico (Kopf). Tras la cirugía, se esperó al menos una semana antes del comienzo del primer ensayo.

• ¿Cuáles son las variables dependientes e independientes? En el caso de las variables independientes ¿qué niveles tienen cada una? En relación a la optogenética, podemos considerar VI la estimulación o no estimulación de las PC, para ello, es necesario a su vez sistematizar la variable fenotípica ChR2-Clorhodopsina. En el ensayo inicial se establece el valor de intensidad de luz máxima sin mostrar efectos de deterioro motor. Para ello, se emplean distintos niveles de intensidad de luz, entre 0 y 110 mW/mm². Las variables dependientes serían el nivel de deterioro motor en el ensayo inicial, y las conductas específicas y operativizadas de locomoción, ansiedad, agresividad y comportamiento social. • ¿Cuáles son los grupos experimentales y cuáles son los grupos de control? Tanto ratones ChR2 como NpHR3 pasan por ambos niveles de la VI: no estimulación (control) y estimulación (experimental). Un diseño, por lo tanto, intrasujeto. • ¿Qué técnicas psicobiológicas se utilizan? (Dado que es probable que no se conozcan, los alumnos/as deberán buscar información sobre las mismas). La optogenética permite el control a través de la luz (destellos de luz provenientes de un láser o un LED) de la actividad de neuronas definidas genéticamente. Las células son primero modificadas genéticamente para expresar unas determinadas proteínas fotosensibles (opsinas), que son canales ionicos, bombas protónicas, o receptores acoplados a proteínas G. Luego, las células genéticamente modificadas son iluminadas con luz de una determinada longitud de onda, activando o inhibiendo los canales iónicos o las bombas de protones, produciéndose la despolarización o hiperpolarización, y consecuentemente la estimulación o inhibición celular. La cirugía estereotáxica constituye el primer paso de muchas de las actividades investigadoras. Se trata de un medio por el cual se colocan una serie de dispositivos experimentales en las profundidades del cerebro, con precisión, requiriendo para ello de: un atlas neuroanatómico que nos indique el camino hacia el lugar concreto y un instrumento estereotáxico para llegar hasta allí. Los primeros estudios realizados en animales utilizaban la electricidad para lesionar distintas regiones cerebrales y fueron eficaces para determinar qué estructuras podrían estar involucradas en el control de determinados comportamientos. Sin embargo, estos primeros ensayos tenían limitaciones considerables y, en ocasiones, llevaron a conclusiones que posteriormente tuvieron que ser matizadas y completadas. Es por esto que en el estudio que estamos analizando determinan que es difícil saber cómo la estimulación eléctrica del vermis influye en el comportamiento; ya que la estimulación eléctrica también activa de manera antidrómica las fibras musgosas, las fibras trepadoras y las entradas moduladoras de otras regiones, lo que podría contribuir a las consecuencias conductuales de la estimulación.

Métodos y resultados relacionados con electrofisiología in vitro. ¿Qué tipo de intervención o intervenciones utiliza?

En relación a la electrofisiología in vitro, los ratones se anestesiaron con isoflurano y se sacrificaron por decapitación. Los cerebros se extrajeron en una solución de corte enfriada con hielo se prepararon rodajas de cerebelo sagital y se realizaron grabaciones en ambos fenotipos de ratones de la estimulación óptica con láser azul de 471 nm o LED ámbar de 590 nm. • ¿Cuáles son los grupos experimentales y cuáles son los grupos de control? Ratones ChR2 y NpHR3 pasan por ambos niveles de la VI: no estimulación (control) y estimulación (experimental). Si bien existe un grupo de ratones no empleados en la experimentación conductual que permite el registro de una sensibilidad óptica similar a las grabaciones realizadas in vitro. • ¿Qué técnicas psicobiológicas se utilizan? (Dado que es probable que no se conozcan, los alumnos/as deberán buscar información sobre las mismas). La electrofisiología es el estudio de las propiedades eléctricas de células y tejidos biológicos. Incluye medidas de cambio de voltaje o corriente eléctrica en una variedad amplia de escalas, desde el simple canal iónico de proteínas hasta órganos completos como el corazón. Concretamente, la electrofisiología in vitro permite la realización de experimentos en células fuera del organismo, permitiendo el estudio aislado de las mismas y facilitando la obtención de resultados más exactos y específicos. Por lo tanto, este tipo de investigación apunta a describir los efectos de una variable experimental en un subconjunto de las partes constitutivas de un organismo.

Métodos y resultados en relación con la locomoción, la ansiedad y la coordinación. ¿Qué tipo de intervención o intervenciones utiliza? Se empleó la intervención optogenética para establecer la relación entre la activación de las PC y deficiencias motoras más sutiles que las descritas en el ensayo inicial. Para el estudio de la coordinación se realizaron dos ensayos consecutivos durante los que recibieron o no estimulación óptica, observándose que esta no afectó al rendimiento de la varilla giratoria. Para evaluar la locomoción, se realizan bloques alternos en campo abierto de 3 minutos de excitación optogenética, observándose ningún efecto sobre la distancia recorrida. Así mismo, el tiempo que pasaron en el centro de la arena, medida de la ansiedad, tampoco se vio afectado. Los ratones se colocaron en una varilla giratoria con una rotación constante de 4 RPM y se dejaron aclimatar durante 1 min. El tiempo de caída se calculó desde el comienzo de la aceleración. La estimulación óptica comenzó 10 s antes del inicio de la aceleración y continuó hasta que el animal cayó. Los ensayos de campo abierto se realizaron en un recipiente cuadrado de plástico blanco opaco. • ¿Cuáles son las variables dependientes e independientes? En el caso de las variables independientes ¿qué niveles tienen cada una?

VI: Estimulación o no estimulación de las PC. VD: En estudio de locomoción, ansiedad y coordinación, las VD fueron operativizadas mediante el rendimiento de la varilla giratoria (coordinación), el análisis de distancia recorrida (locomoción) y tiempo que pasaron en el centro de la arena (ansiedad). • ¿Cuáles son los grupos experimentales y cuáles son los grupos de control? Tanto ratones ChR2 como NpHR3 pasan por ambos niveles de la VI: no estimulación (control) y estimulación (experimental). Un diseño, por lo tanto, intrasujeto. • ¿Qué técnicas psicobiológicas se utilizan? (Dado que es probable que no se conozcan, los alumnos/as deberán buscar información sobre las mismas). Además de la optogenética, en este estudio se emplea la prueba de rendimiento de la varilla giratoria, que permite evaluar el equilibrio, la fuerza de prensión y la coordinación motora de los sujetos, empleado sobretodo en estudios farmacológicos o de lesiones neurológicas. • ¿Qué parámetros se valoran en cada caso? ¿Qué resultados se obtienen? ¿Son o no estadísticamente significativos? La manipulación de la actividad de las células vermales de Purkinje no afecta la coordinación, la locomoción o la ansiedad, aunque la estimulación optogenética de PC a intensidades de luz fuertes (mayores que las utilizadas para ensayos de comportamiento) condujo consistentemente un deterioro motor. Métodos y resultados obtenidos en los experimentos de comportamiento relacionados con la agresividad. ¿Qué tipo de intervención o intervenciones utiliza? En el estudio de los comportamientos sociales y la agresividad se realizó una intervención optogenética de bloques alternos de 1 minuto en ensayos de intruso-residente. Los ratones utilizados en los experimentos de comportamiento se alojaron en un ciclo de luz-oscuridad inverso de 12 horas. Además, se dejaron descansar durante 7 días para la recuperación de la cirugía, después se emparejaron con una hembra adulta durante 7-12 días para finalmente dejar al ratón de nuevo en aislamiento durante 7 días en su jaula habitual. Antes de los experimentos, se les colocó en una habitación oscura y se dejaron habituar durante al menos 1 hora. Los residentes se conectaron a la fibra óptica y se les permitió aclimatarse en su cambio de hogar durante 30 minutos. Los ensayos se detuvieron en el caso de que un animal resultara herido por un ataque o si el residente atacaba continuamente durante más de 60 s. • ¿Cuáles son las variables dependientes e independientes? En el caso de las variables independientes ¿qué niveles tienen cada una? VI: Estimulación o no estimulación de las PC. En el estudio sobre comportamientos sociales y agresividad, se operativiza la VD mediante la medición de ataques, traqueteo de la cola, persecución y amenaza lateral para la agresividad, y de

contacto y olfateo con el instruso para social, así como conductas de auto-aseo. Para aumentar la agresión en la línea base, los residentes se alojaron con hembras durante al menos 1 semana antes de los ensayos. • ¿Cuáles son los grupos experimentales y cuáles son los grupos de control? Los ratones residentes eran ratones C57BL/6N de tipo salvaje (WT) o Ratones Pcp2-cre cruzados con ChR2-EYPF o ratones eNpHR3.0-EYPF (Halo). Los ratones intrusos fueron BALB/c. También se obtuvieron imágenes de la fluorescencia de YPF en ratones Ai32 y Ai39. Tanto ratones ChR2 como NpHR3 pasan por ambos niveles de la VI: no estimulación (control) y estimulación (experimental). Un diseño, por lo tanto, intrasujeto. No obstante, para descartar la influencia distractora de la luz que se escapa de la fibra óptica, se empleó un grupo de control de ratones que no expresan opsinas para realizar el ensayo de cohortes intruso-residente, observándose que no tuvo ningún efecto distractor sobre la conducta agresiva o social. • ¿Qué técnicas psicobiológicas se utilizan? (Dado que es probable que no se conozcan, los alumnos/as deberán buscar información sobre las mismas). Además de la técnica optogenética, en este experimento se realiza un ensayo intruso-residente, el cual se basa en el hecho de que un ratón adulto establecerá su territorio cuando se le proporciona suficiente espacio. Esta territorialidad está fuertemente reforzada por la presencia de hembras y/o experiencia sexual. Como consecuencia , el residente atacará a machos desconocidos, es decir, intrusos en su jaula, permitiendo el estudio de la agresividad y de la interacción social mediante el registro del inicio y duración de múltiples conductas. • ¿Qué parámetros se valoran en cada caso? ¿Qué resultados se obtienen? ¿Son o no estadísticamente significativos? El empleo de la prueba t de student permitió obtener resultados estadísticamente significativos en la relación entre activación de las PC y la conducta agresiva y social. Concretamente, los ataques disminuyeron en un 54%, y aumentó la tasa de auto-aseo al activar las PC. Al inhibirlas aumentaron los ataques y disminuyeron las interacciones sociales. Estos resultados indican que la actividad de los PC en el vermis cerebeloso ejerce una influencia bidireccional sobre el comportamiento agresivo, proporciona evidencia de que en el vermis cerebeloso el disparo de PC elevado suprime la agresión, mientras que la supresión de disparo de PC promueve el comportamiento agresivo.

PARTE III: DISCUSIÓN 1- ¿Qué resultados principales se obtienen con el trabajo? ¿Son compatibles con las hipótesis planteadas por los autores o se han tenido que refutar las mismas? Los registros electrofisiológicos in vitro confirmaron que la estimulación de opsinas microbianas ChR2 podía impulsar aumentos graduales en el disparo de PC que aumentaron con la intensidad de la luz. De manera similar, la estimulación con clorhodopsina disminuyó las tasas de disparo de PC

de una manera dependiente de la intensidad...