Appunti su specificazione asse antero-posteriore in drosophila - Biologia dello sviluppo a.a. 2013/2014 PDF

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appunti di lezioni con informazioni aggiuntive prese da test universitari...

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SPECIFICAZIONE ASSE ANTERO-POSTERIORE IN DROSOPHILA Nell’ovario di Drosophila si trovano tre tipologie cellulari: - OVOCITI - CELLULE FOLLICOLARI - CELLULE NUTRICI ( che sintetizzano un a grande quantità di RNA e di citoplasma che vengono trasferiti all’ovocita mediante ponti citoplasmatici) L’ ovocita e le cellule nutrici fanno parte della linea delle cellule germinali mentre, le cellule follicolari, derivano dalla linea somatica, in particolare dal mesoderma, e circondano il complesso ovocita- cellule nutrici. Queste cellule, oltre ad intervenire nella vitello genesi, contribuiscono anche a stabilire la polarità antero-posteriore e dorso-ventrale dell’uovo. Le cellule follicolari hanno anche la funzione di sintetizzare le proteine dell’involucro e del corion. Le cellule nutrici rivestono un ruolo importantissimo in quanto producono una serie di fattori materni importanti per lo sviluppo dell’embrione. Tali cellule occupano la parte più anteriore della camera ovarica, mentre la porzione posteriore è occupata dall’ovocita e intorno vi sono le cellule follicolari. Proseguendo con lo sviluppo, ‘ovocita diventa sempre più grande e incorpora gli mRNA sintetizzati dalle cellule nutrici. In seguito alla fecondazione dell’ovocita, si assiste al differenziamento, a livello citoplasmatico, del plasma polare che occupa la regione posteriore della cellula uovo appena deposta. Da tale porzione del citoplasma si origineranno le future cellule polari che danno origine alla porzione germinativa della gonade. In questo stadio la cellula uovo è circondata da due involucri, il corion e l’involucro vitellino, entrambi prodotti dalle cellule follicolari. Nella parte anteriore e posteriore, la membrana plasmatica dell’uovo e l’involucro vitellino sono separati da uno spazio pieno di fluido, lo spazio perivitellino. Segue poi lo stadio a BLASTULA SINCIZIALE in cui migliaia di energidi si localizzano lungo la posizione corticale del citoplasma. Le cellule polari sono evidenti nella regione posteriore, in questo stadio comincia la trascrizione dei geni embrionali. Nel frattempo ha inizio la cellularizzazione dell’embrione, durante la quale intorno ad ogni nucleo si forma la membrana plasmatica ( stadio a BLASTULA CELLULARE). Dopo la formazione del blastoderma si verificano una serie di movimenti cellulari , inclusa la gastrulazione al cui termine l’embrione presenta una tipica organizzazione, nota come stria germinativa, in una fase successiva la stri va a formare la stria germinativa allungata, così detta in quanto l’embrione si allunga e si avvolge su se stesso fino a quando l’ultimo segmento si porta a ridosso del prosencefalo. Alcune costrizioni dividono la stria germinativa in 14 unità dette segmenti. Proseguendo, si assiste a un accrescimento dell’embrione e a una chiusura dorsale. In questo stadio il corpo di Drosophila è organizzato in segmenti ben precisi che comprendono: - Parte anteriore ( ACRON) - 3 segmenti toracici ( T1, T2 e T3) che sono protorace, mesotorace e metatorace - 8 segmenti addominali ( da A1 a A8) - 1 segmento terminale ( TELSON)

Oltre ai segmenti vi sono altre strutture funzionali importanti , i parasegmenti. Ogni parasegmento è costituito dal compartimento posteriore del segmento anteriore e dal compartimento anteriore del segmento posteriore. Tali segmenti indurranno il differenziamento delle diverse strutture del corpo dell’adulto. Dal segmento T1 ( protorace) si formeranno le zampe; dal T2 ( mesotorace) si formeranno le zampe e le ali mentre dal T3 ( meatorace) si formeranno le zampe e i bilancieri. La differenziazione di ogni segmento avviene grazie all’espressione di geni selettori specifici definiti geni omeotici. Mutazioni di questi geni inducono modificazioni di alcune parti corporee. Alla base dello sviluppo di Drosophila vi è una cascata genica che inizia con il coinvolgimento dei prodotti di trascrizione dei geni materni prodotti dalle cellule nutrici. Tali geni hanno la funzione di dirigere a segmentazione delle cellule polari; successivamente diventano attivi alcuni geni dell’embrione. Tra i GENI A EFFETTO MATERNO citiamo BECOID e NANO. Essi attivano la famiglia dei GENI GAP. Dunque i geni materni codificano per fattori di trascrizione e ciò implica che essi sono geni

omeotici. Infatti BECOID presenta un omodominio tipico della famiglia di questi geni. Tra i geni GAP si sono HUNCHBACK e KRUPPEL. Hunchback è responsabile dell’attivazione dei geni SEGMENT POLARITY. Questi ultimi attivano l’ultima classe di geni coinvolti nello sviluppo di Drosophila, i GENI ESECUTORI. In tale attivazione sono coinvolti anche i geni GAP e i GENI PAIRRULE in quanto essi attivano i geni omeotici ( ANTENNAPEDIA e ULTRABITHORAX) che , a loro volta agiscono sui geni esecutori. GENI MATERNI (becoid, nanos) GENI GAP (hunchback, kruppel) GENI PAIR-RULE (hairy, fushi tarazu) GENI SEGMENT POLARITY (engrailed, wingless) GENI ESECUTORI (connectin) N.B. le frecce dirette indicano il controllo di un gene di una famiglia su quello di un'altra famiglia; le frecce circolari indicano interazioni tra geni della stessa famiglia.

I geni GAP e PAIR-RULE sono espressi per un periodo molto breve, dallo stadio di blastoderma sinciziale fino allo stadio di stria germinativa. I loro mRNA trascritti on questi stadi hanno una breve emivita. Per conto, i geni SEGMENT POLARITY e i geni OMEOTICI sono espressi ininterrottamente dalla stadio di blastula in poi. I geni GAP e PAIR-RULE e SEGMENT POLARITY sono definiti geni della segmentalità ( la loro attivazione media il passaggio dalla specificazione alla determinazione nel processo di differenziamento). Sono detti GENI DELLA SEGMENTALITA’ in quanto intervengono nella suddivisione in segmenti della stria germinativa . nei mammiferi, l’equivalente della stria germinativa, sono i METAMERI. La formazione dei segmenti ha inizio nella fase di blastula sinciziale. L’espressione dei geni della segmentalità interessa particolari domini dell’embrione, che proseguendo con lo sviluppo, si riducono sempre di più. I GENI GAP sono espressi sotto il controllo de geni a effetto materno, in larghi domini trasversali: la loro mancanza porta alla perdita di intere serie di segmenti. I GENI PAIR-RULE vengono espressi sotto il controllo dei prodotti proteici dei GENI GAP, in 7 domini trasversali regolari. I GENI SEGMENT POLARITY sono espressi sotto il controllo dei prodotti proteici dei geni PAIR-RULE, in 14 segmenti periodici e sono responsabili del mantenimento di alcune strutture ripetute all’interno di ogni segmento. La loro mancanza causa contemporaneamente delezioni e duplicazioni in ogni segmento. I GENI GAP ( hunchback, Kruppel, knirps, tailles e gigant) entrano in funzione dopo che si è verificata la localizzazione dei prodotti dei geni materni e prima che entrino in azione i geni embrionali coinvolti nella determinazione del pattern antero-posteriore dell’embrione. Il gene hunchback è per la maggior parte espressi nella metà anteriore dell’embrione, tanto che i mutanti che mancano di questo gene sono privi della maggior parte dei componenti della testa e di tutti i segmenti toracici. I geni kruppel sono espressi nella regione centrale dell’embrione e gli embrioni che ne sono privi mancano dell’interno torace e dei primi 5 segmenti addominali. Il geni knirps sono espressi nel dominio posteriore e gli embrioni che se sono privi presentano un fenotipo privo quali del tutto dell’addome. Il gene tilles è espresso dei due domini terminali dell’uovo. Entro ogni dominio, la concentrazione delle proteine gap, mostra un picco al centro, che gradualmente diminuisce verso i margini. I GENI PAIR-RULE ( Hairy, evenskipped e runt): sono espressi prima e sono controllati direttamente dai geni GAP. I GENI SEGMENT-POLARITY ( engriled, wigless, hedghog, armadillo, patched): mutazioni di questi geni causano delezioni o duplicazioni nelle corrispondenti porzioni di pgni segmento, spesso associate alla perdita della polarità antero-posteriore all’interno di ogni segmento. Il gene ARMADILLO, all’interno è l’equivalente della β-catenina ( induttore del centro di NewKoop).

GLI ORGANIZATORI DI DROSOPHILA In Drosophila si distinguono tre organizzatori: - ORGANIZZATORE ANTERIORE ( BECOID) - ORGANIZZATORE POSTERIORE ( NANOS) - ORGANIZZATORE DELLE ESTREMITA’ ( TORSO) BECOID, NANOS e TORSO sono geni ad effetto materno coinvolti nella formazione dell’asse anteroposteriore [femmine mutanti per un qualsiasi di questi tre geni possono dare embrioni privi di particolari regioni o con regioni più grandi o duplicate]. Il numero di fenotipi è molto più basso del numero dei geni a effetto materno, il che suggerisce che più fattori materni cooperino nella formazione di specifiche parti dell’embrione. Embrioni mutati per BECOID hanno un organizzazione anteriore alterata e possono presentare riduzione o perdita della testa. Mutazioni per NANOS danno perdita dei segmenti addominali mentre, mutazioni in TORSO determinano l’assenza dell’ acron e telson e dei segmenti ad essi adiacenti. Ciascun sistema con una doppia mutazione, in cui due sistemi sono inattivi, il terzo opera regolarmente, determina lo sviluppo della sua sola regione di competenza. La presenza di tali organizzatori può essere dimostrata irradiando ad esempio la parte posteriore dell’embrione con raggi UV. In questo casi, infatti, vedremo che ne il capo ne il torace si formano, ma avremo due regioni addominali. Distribuzione a gradiente dei segnali materni: durante lo sviluppo embrionale i segnali materi si distribuiscono creando un gradiente di segnali. Tali gradienti interessano i seguenti geni materni: - BECOID + HUNCHBACK anteriormente - NANOS + CAUDAL posteriormente - TORSO alle estremità. In realtà lo troviamo in tutto l’embrione ma in forma inattiva. BECOID è l’equivalente di goosecoid e HUNCHBACK è il primo gene della famiglia GAP ad essere trascritto. NANOS e CAUDAL rendono possibili il differenziamento dell’addome e sono localizzati nella porzione posteriore dell’embrione. La loro concentrazione è la massima alla fine dell’embrione e scema allontanandosi da essa. TORSO controlla l’organizzazione delle estremità che, in Drosophila, sono ACRON e TELSON. - Se manca BECOID si ha addome e 2 telson - Se manca NANOS non si ha l’addome - Se manca TORSO non si hanno acron e telson.

CENTRO ORGANIZZATORE ANTERIORE : BECOID ( testa e torace) a metà dell’oogenesi le cellule nutrici dell’ovario secernono, tra i tanti segnali, BESOID, il quale mRNA viene rilasciato e incorporato dell’oocita. La proteina che deriva dal messaggero di becoid presenta un gradiente spostato verso la posizione centrale dell’embrione, in una area molto limitata. Quando l’oogenesi è completata l’ mRNA di becoid è legato a dei prodotti di EXUPERANTIA , SWALLOW e STAUFEN che lo trascinano nella porzione anteriore dell’embrione. Una volta che inizia la trascrizione, la proteina di becoid diffonde formando un gradiente proteico e reprimendo la traduzione dell’ mRNA di CAUDAL. Successivamente, allo stadio di blastoderma cellulare, la proteina becoid attiva i geni GAP anteriori. Il gene HUNCHBACK è il primo ad essere attivato. Esso presenta un gradiente sovrapponibile a quello di becoid. All’attivazione di HUNCHBACK ( torace) segue quella di altri geni gap quali: orthodenticle, buttonhead e empty spiracles. La proteina becoid diffonde fino all’incirca metà embrione ; hunchback è presente ancor prima che l’embrione inizia a trascrivere il proprio genoma; i gradienti dei segnali si realizzano attraverso l’interazione degli mRNA con il citoscheletro della cellula uovo e tali gradienti sono importanti in quanto regolano la trascrizione dei geni della segmentalità. Per localizzare la presenza di becoid si usa una sonda complementare alla sequenza del suo mRNA che, marcato con una sostanza fluorescente viene inserita nell’embrione. Tanto più sarà il risultato, tanto più abbondante sara la quantità di becoid. Mediante tale analisi denitometrica si può vedere che l’ mRNA di becoid si accumula nella parte anteriore dell’ovocita, nell’area disposta in prossimità delle cellule nutrici, mentre la proteina becoid ha un gradiente localizzato nel primo 2030% dell’embrione.

DISTRIBUZIONE DI BECOID E NANOS SUI MICROTUBOLI Nell’ovocita, durante la fase iniziale di accrescimento, il nucleo è localizzato in prossimità del polo posteriore e i microtubuli sono orientati con l’estremità ( -) verso il nucleo e con l’estremità (+) verso la parte anteriore , cioè verso la regione occupata della cellule nutrici. Questo orientamento, dato che la proliferazione avviene solo all’estremità positiva, favorisce il trasferimento di molecole e organuli dalle cellule nutrici all’ ovocita. In seguito all’espressione di GURKEN , una proteina chinasi A, si ha un inversione di polarità dei microtubuli e quindi il polo (-) è orientato verso le cellule follicolari anteriori e il polo ( +) coinciderà con il futuro lato posteriore dell’embrione. Grazie al loro accrescimento, i microtubuli trasportano NANOS nella parte posteriore. Dunque, esso sarà localizzato in prossimità delle cellule follicolari posteriori, associato alla PROTEINA OSKAR. Nella traslocazione di NANOS intervengono la CHINASINA I , una proteina presente nei microtubuli e OSKAR un segnale che lega nanos. Alla fine di tutti questi processi, becoid risulta localizzato in prossimità delle cellule nutrici, e nanos è situato dalla parte opposta. Quando i microtubuli delle camire ovariche sono ripolarizzati, e grandi quantità di citoplasma sono trasferiti dalle cellule nutrici all’ovocita, l’ mRNA di becoid si accumula nella parte anteriore dell’ovocita, nell’ara disposta in prossimità delle cellule nutrici. L’accumulo dipende dalla localizzazione degli elementi cis-acting agenti localizzati in un estesa regione del 3’-UTR dell’mRNA di becoid. Si tratta di un segmento dell’ mRNA che non è tradotto in una proteine ma ha un importante funzione nel controllare la longevità, la traducibilità e la localizzazione dell’ mRNA. Se alcuni segmenti sono rimossi da 3’-UTR di becoid, il rimanente mRNA non si localizza e diffonde per tutto l’ovocita. Al contrario, se in questi stessi segmenti dell’ mRNA di becoid vengono aggiunti ad un altro mRNA, come quello di oskar, l’mRNA così costituito avrà la stessa localizzazione dell’ mRNA di becoid. Dunque la regione 3’-UTR offre l’opportunità di legame da parte di alcune proteine e protegge l’ mRNA di becoid, assicurandogli una certa posizione. Gli elementi trans-acting, per la localizzazione dell’mRNA di becoid, invece, comprendono i microtubuli, EXUPERANTIA e SWALLOW. Infatti se le ovaie sono coltivate in presenza di colchicina, che inibisce la formazione dei microtubuli, gli mRNA di becoid non raggiungono la poro posizione naturale. Anche in uova derivate da femmine che presentano mutazioni a livello del geni

exuperantia e swallow, becoid presenta una localizzazione ectopica e gli embrioni che si sviluppano da queste uova mostrano della alterazioni della regione anteriore. Le indagini effettuate suggeriscono che gli mRNA di becoid formano dimeri o multimeri mediante i loro 3’-UTR che, integrano con la proteina STAUFEN, formando particelle di ribonucleoproteine garantendone il trasporto a la localizzazione. Per mutanti del gene becoid possono essere effettuati esperimenti di recupero di funzione. Infatti gli embrioni becoid- possono essere parzialmente recuperati iniettando anteriormente il citoplasma anteriore proveniente da un donatore selvatico, in tal modo si formano individui con pattern corporeo normale. L’iniezione nella regione laterale causa la formazione di strutture del capo ectopiche. Infine, l’iniezione nella parte posteriore porta a un embrione normale nella parte anteriore, mentre nella parte posteriore, si ripropongono l’acron, il capo e il torace. Ciò sta a significare che, in quest’ultimo caso , l’azione di NANOS è cancellata e prevale l’organizzatore anteriore.

CONTROLLO DELL’ESPRESSIONE DEI GENI GAP Sulla base della concentrazione di HUNCHBACK si ha l’espressione di una serie di geni GAP lungo l’asse antero-posteriore dell’embrione, a formare molti domini. Allo stadio di balstoderma sinciziale l’espressione di hunchback si osserva nella metà anteriore dell’embrione; allo stadio di blastoderma cellulare si aggiunge un dominio di espressione posteriore, dopo di che l’espressione regredisce verso entrambi i poli. L’espressione di hunchback inibisce quella di altri geni gap quali: KRUPPEL e KNIRPS. Infatti, il gene kruppel, è espresso solo al centro dell’embrione e Knirps in prossimità della regione posteriore, dove la concentrazione di hunchback è più bassa.

Becoid, una volta sintetizzato, si comporta da morfogeno, dando origine a diversi tipi cellulari caratterizzati da una diversa attività genica. Quando la concentrazione è in eccesso la proteina becoid attiva la trascrizione del gene gap KRUPPEL : in embrioni selvatici, kruppel, è attivato da i livelli di becoid presenti nella regione che corrisponde al 40% della lunghezza dell’uovo ( EL) dove lo 0% corrisponde al polo posteriore e il 100% al polo anteriore. La proteina becoid successivamente attiva il gene gap Hunchback e ciò si verifica quando la concentrazione della proteina becoid raggiunge il 50% della EL. L’attivazione del geni hunchback inibisce la trascrizione di Kruppel, per cui l’accumulo di mRNA di Kruppel si verifica solo nella regione equatoriale dell’uovo. Inoltre, la concentrazione locale di becoid, controlla l’espressione di EMPTY SPIRACLES , un gene espresso in una banda di cellule del blastoderma compresa tra il 67 e il 78% del EL. Infine, quando la concentrazione di becoid raggiunge i valori pari a quelli del 75-92% della EL, viene attivato il gene Orthodenticle. Da quanto detto emerge che il gradiente della concentrazione della proteina becoid controlla l’espressione di diversi geni.

CENTRO DI ORGANIZZAZIONE POSTERIORE: NANOS ( addome) Il gene chiave del gruppo posteriore è nanos che può essere considerato come la controparte di becoid. Anche la proteina nanos occupa un territorio più esterno rispetto al suo messaggero., Come avviene per becoid. La proteina nanos è parzialmente localizzata nei granuli polari, particelle di ribonucleoproteine che si assemblano durante l’ovogenesi in prossimità del polo posteriore. L’mRNA di nanos, associato ai granuli polari, agisce come fonte per la formazione del gradiente della proteina nanos. Al contrario dell’ mRAN di becoid, l’mRNA di nanos è presente in tutto il citoplasma nell’uovo ma viene tradotto solo quello localizzato nella regione posteriore. Il segnali matero nanos è prodotto dalle cellule nutrici dell’ovario e controlla l’espressione di alcuni geni gap. Infatti, la proteina nanos, induce la trascrizione del gene KNIRPS e inibisce l’espressione di Hunchback. Dunque la proteina nanos, nella parte posteriore dell’uovo, previene l’accumulo della proteina materna Hunchback che, se fosse presente, indurrebbe l’espressione di Knirps. L’inibizione delle funzioni di hunchback nella parte posteriore dell’embrione da parte di nanos dipende dal GENE PUMILIO: la proteina pumulio lega la regione 3’-UTR del gene hunchback reclutando la proteina nanos a legare questo sito. La presenza di entrambe le proteine in questo sito, promuove la deadenilazione dell’ mRNA di hunchback, cos’ da inibire la sua funzione e accelerare la degradazione. Per ancorarsi ai microtubuli , nanos, utilizza la CHINESINA 1, STAUFEN e OSKAR. Queste molecole sono responsabili della localizzazione finale di nanos nella regione posteriore dell’embrione ( in una regione vicina a quella occupata dalle cellule polari). La presenza negli embrioni dei messaggeri di nanos e pumilio ( formazione dei segmenti addominali) è anche necessaria per il normale sviluppo della linea germinale femminili. Nelle femmine prive del genu pumilio gli ovari contengono pochissime cellule staminali. Oltre a Oskar, nella determinazione del pattern posteriore e nello sviluppo della linea germinale, sono coinvolti numerosi altri geni a effetto matero tra cui cappuccino, spire, staufen, tudor e vasa. In uova che derivano da femmine che mancano di uno qualsiasi di questi geni, non solo mancano i granuli polari ma non presenti alterazioni a livello dell’addome. I geni vasa e tudor sono richiesti per la formazione delle stesse cellule polari, presumib...