Apuntes tema 15. Virus de bacterias o bacteriófagos PDF

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Bacteriófagos.
Profesora: Olga Zafra...

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Marta Cortina Agudo. Universidad Francisco de Vitoria TEMA 15. VIRUS DE BACTERIAS 15.1. DOS CICLOS DE VIDA VIRAL: LISIS VS LISOGENIA Los virus líticos o virulentos destruyen a su hospedador tras la infección, mediante su lisis. Los virus lisogénicos o temperados integran su genoma en el cromosoma del hospedador y conviven durante generaciones sin que el fago cause daño, hasta que el genoma vírico se escinde del cromosoma del hospedador y comienza un ciclo lítico.

15.2. BACTERIÓFAGOS dsDNA Fago T4: fago virulento de grupo I El ciclo lítico es un ciclo replicativo que termina en la destrucción del hospedador mediante lisis. Bacteriofago T4 (Myoviridae) infecta Escherichia coli. Características del fago T4: •

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Virus sin envoltura de estructura compleja: → Cabeza icosaédrica → Cola compleja: tubo helicoidal. → Vaina. → Cuello. → Placa basal con fibras Genoma lineal dsDNA (168 Kpb): → Codifica muchos tipos de proteínas (estructurales, replicación, modificación, nucleasas…). Codifica alguno de sus propios tRNA. Genoma permutado circularmente. Genoma contiene 5-hidroximetil citosina glicosilada: → Modificación con enzimas propias. → Supone resistencia a restricción bacteriana.

Adsorción T4: El receptor de T4 son polisacáridos de la pared celular reconocidos por las fibras. Entrada T4: • •

La lisozima del fago degrada el peptidoglicano de la bacteria. La holina abre un poro. Inyección del genoma por contracción de la vaina.

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Genoma viral protegido por modificaciones (metilaciones y glicosilaciones en cisteínas), las cuales le hacen resistente a los sistemas de inmunidad bacterianas pro restricción.

Primeros instantes de la infección T4: Durante primer minuto: • • •

Cesan la replicación, transcripción y traducción bacterianas. Comienza la transcripción de genes virales. Comienza traducción de mRNA viral.

A los cuatro minutos: •

Comienza la replicación del genoma viral.

Transcripción y traducción virales del fago T4: El fago T4 no codifica para una RNA polimerasa específica. En su lugar, posee proteínas que modifican la especificidad de la RNA pol del hospedador, mediante una estrategia que activa una cascada de factores sigma propios, en la que se sintetizan factores anti-sigma y factores sigma. → Proteínas tempranas: Los promotores tempranos se transcriben con la RNA pol y factores sigma de E.coli_ Un factor anti-sigma del fago que interfiere reconocimiento de promotores hospedador. Secuestra el factor sigma del hospedador. o Se sintetiza un factor sigma 1 propio del virus que reconoce sus propios promotores. → Proteínas intermedias: o

El factor sigma del fago se une a la RNA pol (Ec) para reconocer promotores intermedios. Entre otros, hay una síntesis de otro factor sigma 2 y un factor anti-sigma 1. → Proteínas tardías: El nuevo factor sigma viral reconoce los promotores tardíos de genes que codifican proteínas estructurales de la cápside. Se trata de una transcripción dividida en el tiempo, gracias a la transcripción de factores sigma alternativos.

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Marta Cortina Agudo. Universidad Francisco de Vitoria Replicación del bacteriófago T4: Los viriones portan la misma secuencia de DNA pero las moléculas son diferentes. El genoma está permutado circularmente: • • •

Si lo circularizamos es el mismo genoma. Se encuentra linealizado en distintos puntos. En cada terminación de la doble cadena de DNA hay secuencias repetidas (repeticiones terminales).

En ningún momento de su ciclo de vida el fago T4 circulariza su genoma, es una forma de explicar el fenómeno de permutación circular.

El genoma replica como una unidad y varias unidades genómicas recombinan para formar un concatémero. Durante el empaquetamiento, el genoma se va fragmentando mediante endonucleasa específica (gasto energético) en fragmentos con una longitud concreta hasta que la cabeza del fago se llena. No hay secuencia específica de corte.

Ensamblaje del fago T4: Cabeza, cola y fibras se sintetizan independientemente y luego se ensamblan. Se sintetiza la cápside y el DNA se introduce activamente en la cabeza. Finalmente, se unen la cola y las fibras ya ensambladas cada una por su vía.

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Marta Cortina Agudo. Universidad Francisco de Vitoria Liberación del fago T4: La proteína holina crea huecos en la membrana citoplásmica de E.coli y, posteriormente, la endolisina lisozima degrada el peptidoglicano. Se produce entonces la lisis. Virus atemperados: lisogenia La lisogenia es un estado en el que la mayoría de los genes virales no se expresan y el genoma del virus (profago) se replica en sincronía con el del hospedador. La expresión del genoma viral es lo que daña la célula hospedadora. En cada replicación y división de la bacteria, el profago replica junto con el genoma bacteriano y se hereda de generación a generación. Generalmente, la lisogenia se mantiene gracias a una proteína represora codificada por el fago, pero puntualmente este represor se puede inactivar y el virus lisogenizado puede inducir el ciclo lítico. El profago usualmente está integrado en el genoma hospedador, pero también hay ejemplos de existencia aislada en el citoplasma (elemento episómico). La célula que porta un profago se denomina lisogéno. Durante la lisogenia, el virus atemperado no existe como virión. El profago puede conferir nuevas propiedades al hospedador. Importancia del fenómeno de lisogenia: → Herramientas moleculares, vectores de clonación en ingeniería genética. → Importancia ecológica: muchos aislados bacterianos naturales son lisógenos. → Importancia médica: la virulencia de muchas bacterias patógenas proviene de un profago. Ej.: el genoma del bacteriófago β codifica para la toxina diftérica; Corynebacterium diphtheriae causa enfermedad si es un lisógeno. En procariotas, la lisogenia es un fenómeno dinámico: • • •

Hay un represor del virus que impide la expresión de sus propios genes. También inhibe la expresión génica de fagos relacionados que infecten al hospedador (inmunidad). Si el represor se inactiva o se deja de sintetizar comienza el ciclo lítico: el profago se induce bajo condiciones particulares, por ejemplo, por daño en el genoma. Por alguna mutación el profago puede perder la habilidad de abandonar el genoma del hospedador. Se convierte en un virus críptico. Muchas regiones del cromosoma bacteriano son virus crípticos.

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Marta Cortina Agudo. Universidad Francisco de Vitoria Bacteriófago λ: virus con ciclo lítico y lisogénico El bacteriófago λ es un virus que infecta E. coli. Pertenece al grupo I de la clasificación de Baltimore. •

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Morfología compleja: → Cabeza icosaédrica. → Cola. → Fibras pequeñas y delgadas. Genoma: → dsDNA lineal con extremos cohesivos complementarios en 5’ (48Kb). → Cuando el fago lambda entra en el hospedador, los extremos cohesivos se unen y su genoma se hace circular. La unión de los extremos cohesivos crea un sitio cos, una ligación covalente.

Si hace ciclo lítico: hay replicación por círculo rodante del genoma viral. Se obtiene un concatémero, el cual se corta por los sitios cos. Si hace ciclo lisogénico: el genoma viral se integra específicamente en el sitio attλ (recombinación sitio específica). La decisión de ruta depende del metabolismo y del ambiente. Se trata de una red de regulación que detecta la salud/metabolismo del hospedador, de manera que: • •

Si el metabolismo es muy activo: se inicia el ciclo lítico, ya que permitirá producir una gran cantidad de progenie. Si el metabolismo es poco activo: el virus iniciará ciclo lisogénico.

A nivel molecular intervienen dos proteínas: •

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Proteína CI: represora de λ. Provoca que el ciclo se incline hacia la lisogénesis. Inhibe la transcripción de todos los genes víricos, excepto de la integrasa, la cual permite que los genes víricos se integren en el genoma del hospedador. Proteína Cro: inicia un ciclo lítico. Activa la transcripción de todos los genes víricos, excepto de la integrasa.

Siempre se expresan las dos proteínas, pero la que se exprese en mayor cantidad determinará si se inicia un ciclo lítico o uno lisogénico. Los promotores de los genes que codifican ambas proteínas son tempranos, y su expresión dependerá del estado metabólico de la célula.

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Marta Cortina Agudo. Universidad Francisco de Vitoria 15.3. USOS BIOTECNOLÓGICOS DE FAGOS Los bacteriófagos modificados genéticamente pueden tener diferentes aplicaciones industriales, terapéuticas, biocontroles, biodetección e investigación, aplicaciones veterinarias, etc. Usos biotecnológicos del fago λ: Se han hecho versiones en las que los promotores de CI y Cro se intercambian por promotores dependientes de temperatura, de manera que se puede controlar si el fago hace lisis o lisogenia poniendo la temperatura concreta para la expresión de cada una de las dos proteínas. → Si se quiere que haga lisis y, por lo tanto, usarlo como vector de clonaje, se tiene que poner la temperatura a la que haya expresión de Cro. → Si se quiere que haga lisogenia y, por lo tanto, usarlo como herramienta para hacer transducción se tiene que poner una temperatura a la que haya expresión de CI. Usos biotecnológicos de los bacteriófagos: •

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Vacunación: se unen proteínas víricas en un fago. El tratamiento con el mismo dará una respuesta inmune que creará anticuerpos contra las proteínas expuestas. La respuesta del SI será mayor que si la vacuna solo consiste en una proteína, ya que con el fago se recrea una infección viral real. Biosensores: fagos modificados con genes chivatos o reporter incorporados pueden detectar la presencia de determinadas bacterias y avisar de dicha presencia. Al infectar la bacteria, se produce la incorporación del gen reporter en el genoma bacteriano, de manera que, al expresarse, se podrá observar. Terapia fágica: los fagos son capaces de lisar las bacterias patógenas resistentes a antibióticos. Se trata de un tratamiento alternativo a los antibióticos frente a enfermedades infecciosas. Conocer los mecanismos de lisis del hospedador ha dado lugar a antimicrobianos: → Amurinas: proteínas fágicas que inhiben la síntesis de peptidoglicano del hospedador. → Sistema “holina + endolisina”: Es la estrategia más común entre los fagos. Holina: perfora la mureína y hace accesible el peptidoglicano a las endolisinas. Endolisinas: endopeptidasas, amidasas, glicosidasas. Dependiendo de si el fago infecta una bacteria G+ ó G- hay una dotación de endolisinas distinta. Retos de la fagoterapia: ➢ Es necesario estudiar a fondo la respuesta inmune humana frente a fagos. Actualmente se sabe: los fagos por vía tópica no dan lugar a ningún efecto secundario, los fagos orales provocan desarrollo anticuerpos frente a ellos, los fagos por vía intravenosa provocan una gran respuesta inmune (tanto innata

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Marta Cortina Agudo. Universidad Francisco de Vitoria como específica) de manera que los fagos se eliminan rápidamente sin realizar su función, ➢ Se suelen escoger fagos líticos. La lisis bacteriana puede hacer que aparezcan endotoxinas cuya presencia empeora el estado del enfermo. ➢ El uso de fagos lisogénicos tiene el riesgo de ser una forma de HGT y puede dispersar resistencias o factores de patogenicidad a bacterias inocuas. ➢ Resistencia a fagos : se ha comprobado que, en algunos casos, aparecen cepas bacterianas mutadas en el receptor o con mecanismos de resistencia a fagos. Estudios en curso: → Fagos protegidos por liposomas son más estables en órganos internos de los humanos. → Uso profiláctico de la terapia fágica es semejante al de los probióticos. Los fagos son capaces de eliminar bacterias que provocan diarreas antes de que se multipliquen. Además, regulan la microbiota gastrointestinal. → Fagos contra Campylobacter jejuni de gallinas. La bacteria no afecta a la gallina pero causa intoxicaciones alimenticias en humanos. Estos fagos administrados a gallinas previenen estos problemas → Fagos para control de crecimiento bacteriano durante la manufactura de alimentos.

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