Assaigs d\'unió directa al lligand PDF

Preview

Summary

Download Assaigs d'unió directa al lligand PDF

Description

PROCESSAT DE LES DADES: ASSAIGS D’UNIÓ DIRECTA DEL LLIGAND RECTA DE SATURACIÓ -La recta de saturació és una aproximació estàndard a l’anàlisi de les dades de unió al lligand. -Programes informàtics fan la millor línia de la gràfica, normalment emprant programes no lineals de mínims quadrats. El programa troba la línia que minimitza la desviació que les dades experimentals de la línia. La regressió no lineal per mínims quadrats pot ser il·lustrada emprant la equació d’unió pel model més simple d’un lloc d’unió: - Bmax és la concentració dels llocs d’unió màxima. - L és la concentració en equilibri del lligand lliure. - LS és la concentració del lligand unit. - El terme mínims quadrats indica que els paràmetres Bmax i Kd ajustats són escollits per produir un mínim valor per produir el mínim valor en la suma de les desviacions dels quadrats (SS). El terme no lineal indica que la equació per ser representada no és lineal en Bmax i Kd. - Fer-ho a mà és molt tediós. - Per aconseguir el millor perfil dels paràmetres per una equació no lineal és necessari començar els càlculs escollint unes estimes inicials d’aquests paràmetres. Aquestes estimes són millorades per un procés que es va repetint fins a trobar un bon perfil. Per càlcul dels paràmetres en una equació lineal no fa fan falta unes estimes inicials. El perfil de la corba és molt important per la unió al lligand. Ajuda a determinar si les dades estan el millor ajustades, assumint un lloc d’unió al lligand, dos llocs o més llocs existents, a més de donar les millors estimes dels paràmetres d’unió. -En aquesta corba es pot trobar: Nº de llocs d’unió: tots els llocs d’unió estan ocupats pel lligand quan la concentració del lligand unit esdevé igual que la concentració dels llocs d’unió. - Això passa a la màxima concentració de lligand, en aquest cas, 19pM. - 19pM=19pmols/litre i 19fmols/mL: sabent que hi ha 25 mg de proteïnes per mL de solució, hi ha 19fmols de lligand units per mL, els quals contenen 25 mg de proteïna: hi ha 76 fmols de llocs d’unió per mg de proteïna. Afinitat del lligand pel lloc d’unió: correspon a la concentració de lligand a on estan ocupats els 50% dels llocs d’unió. - En equilibri, l’associació i dissociació són iguals, pel K1 [L][S] =K2 [LS]. - Ka és la constant d’associació de L per S, i té unitats de litres/mols. - Kd, és la constant de dissociació, i té unitats de mols/litre.

-

Com que els llocs d’unió existeixen només com a S o com a LS, la concentració molar total dels llocs d’unió és la Bmax=[S] + [LS]. Similarment, la concentració total de lligand LT=[L] + [LS]. Per tant, Kd també és igual a:

*Si [LS] és molt més petit que Lt, llavors la concentració de lligand serà pràcticament igual a LT, pel que el lligand total afegit serà igual al lligand lliure. EL MÉS SIMPLE MODEL DE DOS LLOCS D’UNIÓ INDEPENDENTS -Assumpcions: Dos homogenis llocs d’unió estan presents. 1 molècula de lligand pot ser unida per cada tipus de lloc d’unió. Els llocs d’unió són completament estables sota condicions experimentals, pel que la concentració total dels llocs d’unió romanen constants. Les molècules de lligand no són modificades durant l’experiment, pel que la seva concentració total també romana constant. L’ampli temps permet arribar a l’equilibri d’unió per a cada tipus de lloc d’unió. Els dos llocs són independents, pel que la unió a un sol tipus de lloc no afecta la unió de l’altre tipus de lloc. -No és normal que un lligand sigui tan selectiu que s’uneixi només a un tipus de lloc d’unió. El més sovint és que hi hagi dos o més tipus de lloc d’unió independents. La unió total (Btot) en tal sistema és la suma de la unió al lligand a cada lloc=[LS1] + [LS2].

-Un lligand pot tenir diferents afinitats pels diferents llocs d’unió. Quan una afinitat decreix, altes concentracions de lligand es requereixen per produir l’escollit grau de saturació. Amb afinitats decreixents, la corba d’unió es mou cap a la recta. Per lligands amb una molt baix afinitat a baixes concentracions, el gràfic és una línia (i no un corba) relacionada amb la concentració del lligand. Això explica perquè la “unió no 2

específica” sovint és una funció lineal de la concentració del lligand. - Totes les corbes tenen la mateixa Bmax. -Si la màxima concentració de [LS1] és de 13 pm, el 50% d’aquesta és la Kd. Per llegir millor els valors dels paràmetres es passen la concentració del lligand lliure a escala semilogarítmica.

Quan un lloc d’unió és present, la concentració del lligand que es necessita per produir el 90% de saturació de la unió és 10Kd; el necessitat per produir el 10% de saturació és 0,1Kd, en un rang de concentració de 100. Si hi ha dos llocs d’unió amb diferents afinitats (amb un factor de 5 o més): es necessitarà un major rang de concentracions de lligand per obtenir una corba de saturació completa. Per un lloc, la ratio de les concentracions de lligand produint un 90% de saturació per produir un 10% de saturació és 100 (2 unitats a escala semilogaritmica). La ratio de les concentracions de lligand produint un 90% i un 10% del total de la unió al lligand és sobre 500:1, en l’exemple. L’extensió de les concentracions sobre la qual la unió té lloc és útil per distingir entre unions d’un lloc o de multi lloc. -La recta A representa la Btot (suma de LS1 i LS2). LS2 no s’uneix significativament per sota de 1nM de concentració de lligand, pel que la Btot hauria de seguir la corba de LS1 fins que la LS2 comencés a unir-se (pels 2nM). LS2 no arriba a la saturació fins als 10.000nM de concentració de lligand, pel que la Btot continua augmentant fins que en aquest punt s’estabilitza (LS1 arriba a la saturació a una concentració menor).

3

-

Per l’ordinador, donant la corba d’unió total i emprant programes de gràfics pot trobar les dues corbes individuals, les quals quan s’uneixen aconsegueixen el millor perfil de les dades d’unió.

-Si el segon lloc d’unió té una molt baixa afinitat pel lligand, llavors a baixes concentracions, on la concentració de lligand és molt més baixa que el valor de Kd pel segon lloc, la unió és lineal a la concentració de lligand. Si LS2 té una baixa afinitat, per què s’uneix més que LS1? - Encara que S1 té una alta afinitat pel lligand, aquesta no té una particular capacitat d’unió (el nombre total de llocs d’unió). La concentració de lligand d’aproximadament 10nM és suficient per saturar S1. - En canvi, S2, té una baixa afinitat pel lligand, però una alta capacitat (total nombre de llocs d’unió). - Una concentració de lligand de per exemple 30nM donarà una major concentració de LS2 que no LS1, no obstant, mentre que S1 bàsicament s’uneix al 100%, S2 només té un % de fracció unida. - A una major concentració de lligand es necessitaria abans LS2 per arribar a la platina. -L’ordinador pot separar aquestes corbes i aconseguir els valors de l’afinitat del lloc d’alta afinitat. Per què la baixa afinitat d’unió és lineal a baixes concentracions? - El gràfic mostra l’unió per quadre llocs diferents (S1 a S4). - S1 té la més alta afinitat, i la part del gràfic a on l’alta afinitat hauria de ser mesurada és mostrada. - S3 té la tercera més alta afinitat. Com l’afinitat disminueix, la part del gràfica on hi ha alfa afinitat és mesurada, convertint-se progressivament menys inclinada. - S4 té una afinitat tan baixa que la línia és lineal a la part de la corba on l’alta afinitat hauria de ser mesurada. -L’alta afinitat d’unió normalment és referit com a unió específica (SB) i la baixa afinitat d’unió com a unió no específica (NSB). Suposem que la unió és estudiada en un rang de concentracions de lligand produint una saturació en el lloc d’alta afinitat però una baixa saturació en el lloc de baixa 4

afinitat. La unió pel lloc de baixa afinitat serà proporcional a la concentració de lligand i la constat de proporcionalitat (KNSB) dependrà del nombre de llocs de baixes afinitats (capacitat) i de l’afinitat del lligand per aquests llocs. La barreja de SN i NSB és molt comú en la unió pel lligand des que: Els lligands poden ser selectius però encara s’uneixen a llocs a baixa afinitat. Algunes unions podrien ser degudes a lligands liposolubles, dividint dins dels fragments dels lípids de la membrana cel·lulars l’orientació dels llocs d’unió, des que la unió al lípids soluble és tal que podria també ser proporcional a la concentració de lligand lliure. A les concentracions de lligands es solien veure’s com a SB (alta afinitat), la unió de baixa afinitat només importava si aquesta era d’alta capacitat. Si aquesta era d’alta capacitat, la petita proporció d’unió donant lloc a baixes concentracions de lligand era encara una significant quantitat d’unió i havien de ser permeses. -Un cop el lloc d’alta afinitat és saturat amb el lligand, l’increment en l’unió total és degut a la baixa afinitat de la unió no específica (NSB). La NSB pot ser estimada dibuixant una línia recta a través d’una paral·lela a l’origen cap a la porció lineal de la corba del total d’unió. Substreient el NSB del total de Btot a cada valor de de concentració del lligand obtenim la unió específica (SB). - SB=Btot-NSB - La concentració de lligand és igual a la NSB a l’exemple.

Un millor mètode d’anàlisi és analitzar la unió total directament per obtenir els millors valors de Kd, Bmax i KNSB. Això és el millor, encara que es pot mesura experimentalment la NSB. - La KNSB no és la constant d’afinitat o la constant de dissociació del lloc de baia afinitat, només representa la pendent de la línia de NSB. Aquest valor depèn de Kd i Bmax del lloc de baixa afinitat.

5

-

La unió total del lligand marcat és mesurat amb les concentracions escollides del lligand marcat, i també per la unió a aquestes mateixes concentracions de lligand marcat en presència d’una alta concentració de lligand no marcat. - El lligand no marcat desplaça al lligand marcat casi completament des dels llocs d’alta afinitat i baixa capacitat, mentre que no té efecte en els llocs d’unió de baixa afinitat no específic i d’alta capacitat. La unió del lligand marcat pot ser ara pres per representar la unió no específica. - L’alta concentració de lligand no marcat dilueix i desplaça el lligand marcat dels llocs SB, però el lligand marcat encara s’uneix bastant als llocs NSB, degut a que els llocs NSB s’uneixen a les concentracions extra de lligand no marcat, o degut a que el lligand no marcat no s’uneix als llocs NSB. *L’elecció del lligand no marcat per definir NSB: unfortunadament, els radiolligands poden experimentar un alta afinitat, desplaçant la unió a llocs irrellevant (com filtres). Amb la unió no específica, s’ha provat químicament, que diferents lligands, coneguts per competir pel receptor d’interès poden ser emprat com a radiolligands d’un lligand no marcat. Similarment, la concentració del lligand no marcat pot ser massa alta (encara que hi ha baixa afinitat, els llocs d’alta afinitat es saturaran eventualment). *Llocs d’unió d’alta capacitat i baixa afinitat: La unió no específica d’alta capacitat és definida com una unió amb molt baixa afinitat, tal que, NSB=Bmax [L]/Kd, a on [L]/Kd és molt menor que 1, o fins i tot de 0,1. La suma de unions no específiques per tant, només són apreciables si la capacitat d’unió Bmax és gran. La unió no específica és per tant d’alta capacitat però de baixa afinitat d’unió. -Hi ha alguns tipus de llocs d’unió que presenten principis i assumpcions similars, podent ser previsibles. Degut a que el rang de la concentració del lligand necessita per mostrar la unió a tots els llocs és tan gran, la figura il·lustra múltiples unions representades en escala logarítmica. Per un anàlisis complet d’aquestes dades és essencial emprat un mètode de regressió no lineal per mínims quadrats per obtenir valors de Bmax i Kd per cada tipus de lloc d’alta afinitat i per estimar qualsevol lloc no específic (KNSB).

6

GRÀFICS -Mirar la unió màxima: si continua creixent a mesura que creix la concentració probablment estem en una unió no específica. -Forma de la corba: una corba petita és típica d’un sol lloc d’unió al lligand; si la corba és més irregular, normalment indica la presència de més d’un lloc d’unió. No obstant, aquestes corbes no són sempre obvies. -Pendent de la corba: si la unió incrementa de un 10-90% per sobre d’un rang de concentració de 100 estem en un model d’un lloc d’unió. Grans rangs indiquen multi llocs.

7...