Biochimie et biologie moléculaire tp PDF

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Summary

Tp intégrés pour comprendre les notions ...

Description

Nom : SAHIN Sila, BRUN Brice Groupe : 5 (binôme CB) But général du TP (3 lignes) : Le but de ce TP est de voir si une modification d’une petite région de la séquence codante de la protéine VgrG va modifier l’activité de dépolymérisation de l’actine dans les cellules. Nous avons voulu voir si la région mutée entraine toujours un changement de morphologie de nos cellules ou non. Compte rendu du TP de Biologie moléculaire But de l’expérience de biologie moléculaire (2 lignes) : Le but de cette expérience nous avons voulu modifier des résidus essentiels à l’activité de la toxine VgrG pour cela nous avons également utiliser des outils de la bio-informatique puis nous avons voulu une mutagénèse dirigée par pcr, par la suite sélectionner les clones recombinants et identifier les clones possédant la mutation. Mutagénèse dirigée par PCR. Quel contrôle avez-vous utilisé ? Programmer le thermocycleur : 1- Etape 1 : Étape d’initiation à 95° 2- Étape 2 : Dénaturation à 95° 3- Etape 3 : Hybridation à 55° Sur quoi se base t’on pour choisir la température de de l’étape 3 ? La température de l’étape 3 dépend de la longueur des séquences des amorces 4- Étape 4 : Comment avez-vous déterminer le temps de cette étape ? Pour déterminer le temps de cette étape nous avons pris en considération la taille de notre fragment à cloner. La taille de notre fragment étant de 3285 bp, cette étape nécessite 1 minute par kb donc on estime qu’il faut 4 minutes pour réaliser cette étape. Les étapes 2 à 4 sont répétées 20 fois. 5- 72 °C pendant 10’ 6- 16°C pour le conserver jusqu’à utilisation Les produits PCR sont digérés par DpnI, pourquoi ? Le DpnI est une enzyme qui reconnait et coupes les sites de restriction. Une étape de digestion par DpnI détruit les plasmides (méthylés), ne laissant que les ADNs produits par la polymérase. L'action de DpnI permet de linéariser de manière spécifique le plasmide circulaire parental, et ainsi de le neutraliser avant transformation dans E. coli.

Transformation des bactéries chimio-compétentes A quoi sert cette étape ? Cette étape permettra aux bactéries d’incorporer l’ADN mais elle doit être réalisée en plusieurs étapes. L’incorporation de l’ADN dans nos bactéries nous permettra de crée des

colonies contenant le plasmide. Ces colonies permettent de réaliser des études afin de comprendre l’expression de cette ADN au niveau de la bactérie. Quel est le contrôle ? Le contrôle est un plasmide contenant la séquence VgrG-ACD non muté. C’est quoi un choc thermique ? A quoi sert-il ? Un choc thermique est l’augmentation de la température à 42° qui nous permettra d’augmenter la fluidité de la membrane plasmique de nos bactéries et donc de favoriser l’incorporation et le passage du plasmide a l’intérieur des cellules en créant des pores. L’apparition des pores est dû à la différence de pression entre le milieu intérieur et le milieu extérieur. Pourquoi les bactéries sont incubées 1hrs30 à 37°C avant étalement sur milieu sélectif ? Cette incubation permet aux bactéries de pouvoir récupérer le plasmide et de pouvoir se multiplier. Pendant ce temps, on va laisser les bactéries exprimer la résistance aux antibiotiques et l’ADN amplifié grâce aux machineries de transcriptions et de traductions. Cela nous permettra par la suite de les sélectionner. Comment allez-vous sélectionner les transformants ? Une fois les bactéries déposées sur le milieu sélectif, seuls les clones qui aurons bien recombinés le plasmide seront présent et résisterons à l’antibiotique placé sur notre boite de pétri. Toutes les colonies ayant mal recombinés le plasmide ne survivront pas car elles n’auront pas la possibilité de résister à cet antibiotique. Photo des boîtes après transformation de nos bactéries.

DH5 contrôle

BL21/pet28a WT

DH5 Essai

Conclusion : On ne remarque aucunes colonies dans la boite de Pétri DH5 contrôle car le DpnI à bien digéré les plasmides contenant l’ADN parental méthylé. Cependant dans la seconde boite de Pétri DH5 essai on observe quelques colonies donc on peut en déduire que la transfection a bien fonctionné et que ces bactéries possèdent le plasmide recombinant qui s’est bien refermé. D’une part nous observons des colonies ce qui se traduit que les plasmides ont bien été transfecter dans les bactéries BL21.

Faîtes un schéma pour expliquer le contrôle de l’expression du gène recombinant dans un système BL21(DE3)/pET28a :

Triangle bleu correspond au promoteur T7.

Identification des transformants avec un plasmide muté Quelle technique avez-vous utilisez ? On réalise une PCR sur colonie. Pour effectuer cette PCR nous avons utilisés une amorce qui s’hybride au niveau de la mutation Pst1 (spécifique au mutant) et une au niveau du terminateur T7. Quelle est la fidélité de la polymérase utilisée ? est-ce un problème ? La polymérase utilisée est très efficace et d’haute-fidélité. Cependant cette polymérase est capable de réaliser beaucoup d’erreur comparé à celle de la Pfu. Mais ce problème n’est pas très important dans notre cas car on réalise une PCR analytique et non préparatoire. Cette technique analytique permet de détecter es séquences d’ADN spécifique présent dans un produit. Comment avez-vous sauvegardé les clones portant la mutation ? Afin de pouvoir garder les clones portant les mutations nous avons pris une boite de Pétri divisée en 8. Sur chaque part nous avons touché une colonie sur la boite de Pétri DH5  essai puis toucher un endroit de la boite et mis ceci dans un tube à PCR. Sachant que nous retrouvons des millions de bactérie dans une colonie on peut en déposer sur notre boite.

Boite de Pétri avant incubation

Boite de Pétri après incubation à 37° pendant une nuit

Voici le programme : 1- Étape 1 à déterminer. Justifiez Cette étape est appelée étape d’initialisation. Cette phase est nécessaire uniquement pour les ADN polymérases qui nécessitent l' activation de la chaleur par PCR démarrage à chaud. Il consiste à chauffer la chambre de réaction à une température de 95° et maintenu pendant 10 minutes. 2- 95°C pendant 30’’ 3- 55°C pendant 30’’

4- 72°C pendant 1’ Les étapes 2 à 4 sont répétées 20 fois. 5- 72 °C pendant 10’ 6- 16°C pour le conserver jusqu’à utilisation Comment avez-vous analysé les produits de PCR ? Afin de pouvoir analyser les produits de PCR nous avons réalisés une électrophorèse sur gel d’agarose. L'électrophorèse sur gel d'agarose est une méthode utilisée en biochimie et en biologie moléculaire pour séparer l'ADN, l'ARN ou des protéines en fonction de leur masse moléculaire Avant de réaliser la migration sur gel d’agarose nous avons préparé le gel d’agarose. Comment fonctionne le bromure d’éthidium ? Le bromure d’éthidium est un agent intercalant utilisé comme marqueur d'acide nucléique en biologie moléculaire. Lorsqu'il est exposé à des rayonnements ultraviolets, il devient fluorescent avec une couleur rouge-orangée. L'utilisation la plus courante est la coloration des gels servant à la séparation des fragments d'ADN par électrophorèse.

Photo de l’électrophorèse d’agarose résultats

Nos

Marqueur de taille Conclusion D’après les informations données, l’ADN à une taille d’environ de 1500 kb. Grâce au marqueur de taille et les résultats que nous avons obtenus, on peut identifier une nette migration autour de 1500 kb. Donc nous pouvons conclure que les plasmides ont bien été transfecter dans les bactéries.

But de l’expérience de biochimie : Le but de ce TP est de surproduire la protéine VGR afin qu’on puisse étudier et de déterminer sa masse moléculaire. Le but de cette expérience est de purifier notre protéine sauvage par la suite utiliser cette protéine afin d’analyser si la protéine pouvait traverser la membrane des globules rouges.

Surproduction de la protéine recombinant par les bactéries BL21(DE3) Décrire la procédure : Pour commencer nous avons préparés un milieu frais contenant l’antibiotique qui est la kanamycine et du milieu LB dans un erlenmeyer. Par la suite nous avons ajoutés un tube de culture ayant E. coli transformée avec pET28a_ACD WT ou pET28a_ACD muté. Après cette préparation, les erlenmeyers ont été incuber à 37° pendant 2 à 3 heures sous agitation ce qui permettras aux bactéries de se multiplier. Pendant la surproduction l’absorbance sera mesurée afin de pouvoir ajouter l’inducteur IPTG. Pour ceci nous avons attendu que l’absorbance atteigne une valeur de 0,6. Après induction, les bactéries ont été incuber à 17° durant la nuit. Mais juste avant 1 ml de cette a était récupérer nommer NI donc non induit.

Quels sont les contrôles que vous avez collectés ? Les contrôles que nous avons collectés sont le « non induit », bactéries avant induction par IPTG. Et le CT « cellules totales » prélevé le lendemain. Purification de la protéine recombinante Décrire la procédure : Afin de pouvoir purifier une protéine ce qui signifie à éliminer tous les autres agents non nécessaires et pour avoir une protéine pure. Pour obtenir cette protéine pure nous avons utilisé la méthode de chromatographie d’affinité. - La première étape consiste à équilibrer la colonne avec du Tampon A. Le tampon A contient du tris-HCl, NaCl. - Deuxième étape : dépôt du lysat clarifier dans la colonne - Troisième étape : récupération ce qu’il sort de la colonne afin d’analyser les protéines non retenues - Quatrième étape : lavage de la colonne avec tampon A et récupération de l’éluât pour montrer qu’il ne reste aucunes protéines accrochées. - Cinquième étape, étape d’élution de la protéine recombinante et par la suite réalisation des fractions afin de déterminer la concentration de chaque fraction grâce à l’absorbance. Détailler le principe de la chromatographie d’affinité utilisée et notamment pourquoi avoir utiliser un pH de 7,5 dans le tampon.

Le principe d’une chromatographie d’affinité nous permet de séparer les composants d’un mélange donc de purifier substance. Cette méthode utilise les interactions biologiques afin d’obtenir une purification très efficace dont une efficacité de 90%. La molécule que nous souhaitons purifier est liée aux billes de la chromatographie par des interactions spécifiques. Des lavages sont effectués pour éluer les autres molécules, ces lavages se font avec des solutions de différents ph. Utilisation d’un ph à 7,5 permettra de neutraliser certaines molécules afin de pouvoir interrompre les interactions.

Quelles sont les échantillons contrôles conservés au cours de la purification et dans quel but ? Les échantillons contrôles conservés au cours de la purification sont : - L’échantillon « non induit » c’est-à-dire la protéine produite sans IPTG. - L’échantillon « cellules totales », protéine récupérer lendemain après surproduction Le but de conserver ses échantillons afin de voir si notre chromatographie d’affinité a bien fonctionnée. Vérification de la pureté de la préparation Décrire la méthodologie en une ligne A quoi sert le glycérol dans le tampon de charge ? le bleu de bromophénol ? le SDS ? le DTT ? pourquoi un pH à 6.8 ? Le glycérol a un rôle de pouvoir maintenir la solution dans le gel en faisant du poids. Le bromophénol sert à colorer les protéines qu’on puisse les observer sur le gel de polyacrylamide. Le SDS est une substance permettant de dénaturer et de linéariser les protéines pour effecteur la migration. Le DTT permet de casser les ponts disulfures existants dans la protéine. Pourquoi doit chauffer les échantillons à 100°C avant dépôt sur gel ? Les échantillons doivent être bien chauffer avant d’être déposés afin de bien dénaturer la protéine et réaliser une migration efficace. Comment fonctionne le bleu de coomassie ? Le bleu de coomasie nous permet de visualiser la migration sur le gel d’SDS page. Ce colorant affiche une affinité toute particulière avec les protéines ce qui lui octroie un pouvoir de pénétration rapide et facile au sein du gel de polyacrylamide. Dans un milieu acide, le bleu de Coomassie permet de colorer les protéines et de les fixer. Il se lie aux acides aminés comme l'arginine (Arg, R), la tyrosine (Tyr, Y), le tryptophane (Trp, W), l'histidine (His, H) et la phénylalanine (Phe, F)

Quelle est la taille in silico de votre protéine ?

D’après notre SDS page nous pouvons déterminer la masse moléculaire de notre protéine grâce au marqueur de taille ayant des masses molaires connu. Donc nous pouvons déduire que la protéine fait 43 kDA.

Photo de l’électrophorèse SDS-PAGE

MT

NI

CT LC

NR

L

E1

E2

E3

E4

200 150 120 100 85 70 60 50 40 30 25 20 10

MT : Marqueur de taille NI : Non induit CT : Cellules totales LC : Lysat Clarifié NR : « Non retenu » (protéines non retenu) L : Protéine décrochés par lavage « lavage » E1, E2, E3, E4 : Fraction d’élution

Conclusion :

On peut voir que dans nos fractions d’élutions, on a des concentrations et des quantités de protéines différentes qui correspondent aux différents lavages effectués. Lors de notre

premier lavage, la majorité des protéines se sont décrochés de la colonne ce qui explique la marque très prononcée sur notre gel. Au fur et à mesure des lavages, la plupart des protéines étaient déjà décrochés ce qui explique pourquoi la quantité de protéine devient de plus en plus faible dans nos fractions d’élutions. Au plus on réalise de lavages, au moins il reste de protéines à décrocher sur la colonne.

Comment pourriez-vous améliorer votre purification ? Afin de pouvoir améliorer notre purification nous pouvons modifier la concentration d’inducteur afin de pouvoir produire plus de protéine. Sinon modifier la durée d’induction des plasmides pour avoir suffisamment de protéines. Dernièrement modifier la température de croissance des micro-organismes....