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TP Activité amylasique et GA3

But et principe de la manipulation : L'amylase est une enzyme de l'albumen des graines à aleurones qui transforme les réserves sucrées d'amidon en maltose utile pour le développement de l'embryon.

La gibbérelline est une phytohormone produite par l'embryon qui a une influence sur l'activité enzymatique de l'amylase.

On veut montrer l'effet de l'acide gibbérellique (un gibbérelline) sur l'activité de l'amylase en mesurant le taux de maltose produit sur une échelle de temps par l'amylase dans les graines et en −1

−1

fonction de la masse de matière végétale avec laquelle on travaille ( m(maltose). g . min ) .

Puis on veut comparer la vitesse de réaction dans trois cas de figure possibles : •

Graines entières dans l'eau distillée, qui contiennent donc un embryon et donc de l'acide gibbérellique naturel.

•

Demie-graines, auxquelles on a retiré l'embryon, donc qui ne possèdent pas d'acide gibbérellique naturel, mais qui ont été plongées dans une solution d'acide gibbérellique synthétique à 10 µM .

•

Demie-graines dans l'eau distillée, auxquelles on a retiré l'embryon, donc qui ne possèdent pas d'acide gibbérellique naturel.

Synoptique de la manipulation Matériel végétal Les graines d'orge fournies sont soit entières, en germination depuis

48h , soit ont été coupées

transversalement, de façon telle qu'une partie contienne tout l'embryon et l'autre partie un fraction de l'albumen (où se trouve l'amylase) et de la couche à aleurone, mais pas d'embryon (où se trouve l'acide gibbérellique). Après stérilisation superficielle et rinçage à l'eau stérile, ces demiegraines sans embryon ont été mises dans des boîtes de Pétri, soit sur eau distillée, soit sur une −5

solution de GA 3 à 10 M . Les boîtes ont alors été placées à 25 °C pendant 48h . Extrait enzymatique Pour extraire l'amylase, le matériel végétal est broyé dans un mortier, préalablement placé dans la glace, avec un peu de sable de Fontainebleau. Ajouter un peu de tampon acétate, broyer de nouveau. Filtrer sur gaze, recueillir le filtrat dans un tube à centrifuger, rincer le mortier avec un peu de tampon et joindre le liquide au filtrat.

Centrifuger à 5 000 t /mn pendant 10 mn . Prélever le surnageant et l'ajuster à 50 mL dans une fiole jaugée. C'est 'extrait enzymatique

( V f = 50mL ) , qui devra être placée dans la glace fondante. Milieu réactionnel Pour préparer ce milieu, on mélange trois volumes de prélèvement : •

V p = 3mL d'extrait enzymatique.

•

V p = 9 mL de tampon acétate.

•

V p = 5 mL de solution d'amidon.

On obtient donc un V f = 3 + 9 + 5 = 17 mL de milieu réactionnel.

Cinétique enzymatique On met le milieu réactionnel à incuber, pour déclencher la réaction enzymatique, et on fait des prélèvements de V p = 2mL à t 0 (avant de mettre à incuber), t 5 , t 10 , t 20 et t 30 . Pour chacun des prélèvement ont mesurera la DO . Matériel végétal •

0,840 g de graines entières dans l'eau.

Préparation des différentes solutions •

Masse à peser pour préparer

100 mL de solution mère de maltose 1mg.mL−1 :

0,1 g = 100 mg . •

Masse à peser pour préparer 50 mL de solution d'amidon à 1% : 0,5 g = 500 mg . Un pourcentage massique

1% correspond à 1g de soluté (amidon) dans 100g de

solvant (tampon acétate). On considère que le tampon acétate a une densité égale à celle de l'eau, donc 100g = 100mL . On veut donc préparer une solution mère d'amidon à −1

0,01 g.mL .

Lecture des DO Gamme étalon Masse de maltose dans le tube (mg )

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

Volume de solution mère de maltose (mL )

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

2,0

1,6

1,2

0,8

0,4

0

0

0,096

0,293

0,496

0,695

0,894

Volume d'eau distillée (mL )

DO (λ max = 500nm )

La droite obtenue a une équation :

y = mx − b La droite du maltose ne passe pas par 0 , car le maltose finit par dériver à concentrations très faibles.

Droite étalon 0,9 0,8

DO (500 nm)

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 -0,1 0

0,5

1

1,5

2

Masse de maltose (mg)

En la traçant sur le graphe, on peut substituer l'équation de la droite par :

DO = mx − 0,04 On utilise les deux points les plus extrêmes qu'on connaît de la droite pour calculer sa pente

( 0 , 0 ) ; (2 , 0.894 ) x1 y 1

x2

y2

( m) .

On calcule m =

Δy Δx

0,894 − 0 y −y = 0,447 , donc : = x 22 − x 11 = 2 − 0

DO = 0,45 x − 0,04

x=

DO + 0,04 0,45

Cinétique enzymatique des graines entières Tubes Durée de la réaction

(mn )

DO (λ max = 500nm )

0

1

2

3

4

0

5

10

20

30

0

0,257

0,541

1,087

1,417

Résultats : On utilise l'équation de x définie précédemment pour calculer la masse de maltose dans le tube.

x=

Durée de la réaction

(mn )

Masse de maltose dans le tube (mg )

DO + 0,04 0,45

0

5

10

20

30

0

0,66

1,29

2,50

3,24

On a donc calculé la masse de maltose produite par l'enzyme à chaque temps

t . Mais cette

production n'est valable que pour les V p = 2mL de prélèvement qu'on a fait à chaque temps t pendant la cinétique. Il faudra par la suite remonter dans les calculs, pour arriver à l'activité de l'amylase dans le matériel végétal de départ

Estimation de la vitesse de réaction enzymatique On trace la droite de production de maltose pendant la cinétique :

Courbe de cinétique enzymatique 35

Temps de réaction (mn)

30 25 20 15 10 5 0 0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

Masse de maltose (mg)

Si on attend assez longtemps pour que l'enzyme atteigne sa v max , le graphe aura la forme d'une courbe. Dans ce cas, il faudra tracer une tangente à l'origine de la courbe, pour calculer sa pente, qui sera la vitesse initiale de l'enzyme.

Comme ici on n'a pas laissé la réaction se faire assez longtemps (ou assez rapidement), la droite qu'on obtient peut être utilisée pour calculer la vitesse initiale de la réaction.

m = vi =

Δ Q(P) Δ m(malt) 3,24 − 0,92 Δy = = = = 0,108 mg.mn−1 Δx Δt Δt 30 − 0 Explication des résultats obtenus

On étudie trois échantillons : 1. Demie-graines dans solution de GA 3 . 2. Graines entières dans l'eau. 3. Demie-graines dans l'eau.

La vitesse de réaction des graines dans l'eau sera supérieure à la vitesse de réaction des demiegraines en solution de GA 3 , qui sera à sont trou supérieure à la vitesse des réactions dans les demie-graines dans l'eau (qui sera nulle).

Ceci parce que les graines entières contiennent encore l'embryon, donc de l'acide gibbérellique naturel, qui est plus efficace que l'acide gibbérellique de synthèse dans lequel sont plongées les

demie-graines du premier échantillon. Les demie-graines du troisième échantillon ne contiennent ni acide gibbérellique naturel ni acide gibbérellique synthétique, donc l'action de l'amylase sera nulle (ou presque).

Activités enzymatiques La vitesse de réaction de 0,108 mg.mn

−1

qu'on a calculé pour les 2mL de prélèvement de

cinétique n'est valable que pour ce V p = 2mL . Or nous on s'intéresse à l'activité de l'enzyme dans le matériel végétal de départ. Il faudra alors remonter dans les calculs, en multipliant les activités de chaque volume prélevé par un facteur de dilution, jusqu'à arriver a l'activité dans le matériel végétal.

Ce facteur de dilution est calculé ainsi :

D = fd =

Vf Volume final = Vp Volume de prélèvement

Donc, pour calculer la vitesse de réaction dans le milieu réactionnel ( V f = 17 mL ) , duquel on a pris 2mL on calcule :

17 v i (2mL)⋅D(17mL) = 0,108 ⋅ = 0,918 mg.mn−1 = v i (17mL) . 2 Puis, on calcule la vitesse de réaction dans l'extrait enzymatique

( Vf = 50mL) , duquel on a pris

3mL pour préparer le milieu réactionnel :

vi (17mL )⋅D (50mL) = 0,918

⋅50 = 15,3 mg.mn−1 = v i (50mL ) . 3

Puis finalement, on veut calculer l'activité enzymatique dans la graine. On a dilué une certaine masse de graines (après broyage) pour la dissoudre dans cette solution de diviser la vitesse enzymatique dans les

50mL , donc il faut

50mL ( vi (50 ml)) par la masse de graines qu'on a

dissout :

v i (50mL) 15,3 mg.mn−1 −1 −1 = = 18,21 mg.mn . g m(mat veg) 0,840 g...