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Aleyna Gürbüz

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Q1.2- Gene & Gentechnik Bau und Vermehrung von Bakterien Bau von Bakterien

Vermehrung von Bakterien Konjugation   

Zwei spezielle Organelle der Bakterien befähigen sie zur Weitergabe von genetischer Information an andere Bakterien. Das Plasmid stellt einen kurzen DNA-Ring dar, der Pilus kann wie eine Injektionsnadel eine Verbindung zu einer anderen Bakterienzelle herstellen. Über den Pilus gelangt eine durch Replikation gebildete Kopie des Plasmids in die Partnerzelle. Ein Problem ist dies deshalb, weil wenn Bakterien eine Resistenz gegen Antibiotika entwickelt haben, ist diese Information im Erbgut abgespeichert und kann in Form von einem Plasmid weitergegeben werden o Im Krankenhaus werden ungefährliche Bakterien durch die Verwendung von Antibiotika resistent. Wenn sich also ungefährlich-resistente Bakterien mit gefährlichen-nichtresistenten Bakterien austauschen, entstehen gefährlich-resistente Bakterien

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Regulation der Genaktivität (Prokaryoten) Substratinduktion 

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Man gibt zuerst Glucose, dann Lactose zum Bakterium, was für diesen ein Nahrungswechsel ist. Dies führt zu einem verzögerten Zellwachstum. o Die Verzögerung geht darauf zurück, dass Enzyme zum Abbau von Lactose (Lactase) nur hergestellt werden, wenn Lactose als Substrat (Nährstoff) zur Verfügung steht (regulierte Gene). Da man hier das abzubauende Substrat benötigt für die Bildung der nötigen Enzyme, spricht man von Substratinduktion. Der Repressor ist hierbei aktiv, wenn kein Substrat zur Verfügung steht Der Repressor ist inaktiv, wenn ein Substrat an diesen bindet. Das Operonmodell ist die Substratinduktion am Beispiel des Lactoseabbaus.

Operonmodell (ohne Lactose)   

Das Regulator-Gen wird transkribiert, es bildet sich die mRNA, die dann translatiert wird, und es entsteht ein Repressor. Der aktivierte Repressor bindet dann an den Operator. Die RNA-Polymerase kann nicht weiter Synthetisieren, es entsteht keine Lactase, die dann die Lactose abbaut.

Operonmodell (mit Lactose)    

Das Regulator-Gen wird transkribiert, es bildet sich die mRNA, die dann translatiert wird, und es entsteht ein Repressor. Der aktive Repressor wird durch die Lactoseanlagerung, was die Konformationsänderung bewirkt, inaktiv. Da der inaktive Repressor nicht an den Operator binden kann, kann die RNA-Polymerase an den Promotor binden und wie gewohnt weiter synthetisieren. Nach der Transkription und Translation ist dann das Enzym Lactase entstanden, und Lactose kann nun abgebaut werden.

Endproduktrepression 2

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Das Regulator-Gen wird transkribiert, es bildet sich die mRNA, die dann translatiert wird, und es entsteht ein inaktiver Repressor. Der inaktive Repressor lagert sich nicht an den Operator, es entstehen Enzyme, die die Herstellung von Tryptophan katalysieren.

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Wenn ein Überangebot von Tryptophan vorliegt, hemmt es seine eigene Synthese, indem sich ein Tryptophanmolekül an den Repressor anlagert. Der Repressor wird aktiviert und kann durch die Konformationsänderung an den Operator binden. o Synthese der Strukturgene ist blockiert.

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Da hier das Endprodukt seine eigene Synthese blockiert, spricht man von der Endproduktrepression.

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Regulation der Genaktivität (Eukaryoten) Promotor-Region  

Sie ist die Erkennungsstelle für die RNA-Polymerase und bewirkt den Start der Transkription. In der Promotorregion gibt es (häufig) eine Basensequenz, die reich an Adenin und Thymin ist (TATA-Box). o Mutationen im Bereich der TATA-Box setzen die Promotorfunktion und damit die Transkriptionsrate deutlich herab.

Transkriptionsfaktoren 

Dies sind Regulator-Proteine, die an die Promotorregion binden und der Anlagerung sowie Aktivierung der RNA-Polymerase dienen.

Enhancer & Silencer Enhancer (Verstärker) binden, nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip, an Aktivator Proteine. Durch die Schleifenbildung der DNA wird der Kontakt zwischen ihnen und den Transkriptionsfaktoren am Promotor ermöglicht.  So wird die Transkription stimuliert.  Silencer (Dämpfer) unterdrücken die Transkriptionsaktivität.  Aus dem Zusammenspiel mehrerer Enhancer und Silencer ergibt sich die Transkriptionsrate des Gens.

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Alternatives Spleißen  

Das Spleißen erfolgt nach der Transkription. Es werden nicht nur Introns, sondern auch ein oder mehrere Exons aus der prä-mRNA rausgeschnitten. o Aus dieser prä-mRNA können verschiedene, reife RNA-Moleküle entstehen. o Es erhöht sich somit die Zahl der Proteine, die ein einzelnes Gen codieren kann.

Epigenetische Modifikation durch DNA-Methylierung     

Methylierung = die Bindung von CH3-Gruppen an Basen der DNA Die betroffenen Gene sind nicht mehr zugänglich für die RNA-Polymerase Eine Veränderung der Genaktivität, ohne Veränderung der Basenabfolge nennt man epigenetische Veränderung. Methylierungen können bei der DNA-Verdopplung mitkopiert werden, und gelangen so in die nächste Zellgeneration. Durch das Entfernen von Methylgruppen können Gene wieder aktiviert werden.

Genaktivierung durch Hormone   

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Das Hormon gelangt mit einem Transportprotein in die Zelle (Diffusion) Das Hormon löst sich dann vom Transportprotein und bindet an einen Rezeptorprotein, und gelangt so in den Zellkern. Das Rezeptorprotein mit dem Hormon bindet an die DNA und dient als Hilfe für das Hormon. Sie vermittelt die Bindung an die DNA. o Die Bindung des Hormons bewirkt, dass sich das Rezeptorprotein so verformt, sodass er an die DNA binden kann. Hormon-Rezeptor-Komplexe wirken als Transkriptionsfaktor, die durch die Bindung mit der RNA-Polymerase die Wahrscheinlichkeit für die Transkription der Folgenden Gene erhöhen. o Enhancer

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Genmutationen  Die Genmutation tritt am häufigsten auf. Sie betrifft immer nur ein einzelnes Gen. Dieses Gen wird verändert durch Punktmutationen.

Punktmutationen      

Substitution: Basenpaar wird ausgetauscht Insertion: Basenpaar wird hinzugefügt o Verschiebung des Leserasters => Rasterschubmutation Deletion: Basenpaar wird gelöscht o Verschiebung des Leserasters => Rasterschubmutation Stumme Mutation: durch Austausch des Basenpaares wird ein anderes Codon gebildet, jedoch wird es in dieselbe Aminosäure übersetzt. Missense Mutation: falsche Aminosäure wird eingebaut Nonsense Mutation: codieren eines Stopp-Codons

Chromosomenmutation  Chromosomenmutationen bezeichnen die Strukturänderung eines Chromosoms  Deletion: ein Bereich eines Chromosoms wird entfernt, dies betrifft verschiedene Anzahl von Nucleotiden  Inversion: ein Teilstück des DNA-Stranges wird herausgeschnitten und an der gleichen Stelle in umgekehrter Orientierung wiedereingesetzt.  Insertion: mehrere Basenpaare werden in den DNA-Strang eingeführt  Duplikation: Wenn ein Chromosom in einzelne Stücke zerbricht, kann es vorkommen, dass diese Teilstücke an ein homologes Chromosom anbinden. o Die betreffenden Stücke sind demnach an dem Chromosom doppelt vorhanden.

Genetischer Fingerabdruck Genetischer Fingerabdruck 

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Beim genetischen Fingerabdruck nutzt man die Tatsache, dass sich bestimmte Basensequenzen im nicht codierenden Teil der DNA tandemartig wiederholen. o Diese Wiederholungseinheiten nennt man short tandem repeats (STR). o Sie besitzen eine hohe Mutationsrate und unterliegen nicht der Selektion Die Anzahl der Repeats ändert sich von Individuum zu Individuum, jedoch ist die Wahrscheinlichkeit sehr hoch, dass zwei Personen zufällig dieselbe Anzahl an Repeats haben. o Deswegen kombiniert man mehrere STR-Genorte und erhält so ein Muster verschiedener STRs, mit deren Hilfe man eine Person identifizieren kann. o Dafür wird zuerst die DNA isoliert und mit PCR vervielfältigt. Es ist von Vorteil, dass die vor und hinter den STRs liegenden Basensequenzen bei allen Menschen gleich sind. o So lassen sich Primer konstruieren, die die STRs genau umfassen. Durch die Gelelektrophorese folgt die Auftrennung der vervielfältigten STRs. Beim Vaterschaftstest nutzt man die Tatsache, dass STRs mit ihrer spezifischen Zahl an Wiederholungen vererbt werden. o Das Kind erhält von der Mutter ein Chromosom mit z.B. 7 Wiederholungen, und vom Vater mit 9 Wiederholungen. o Bei der Gelelektrophorese zeigen sich dann zwei verschiedene Banden (7/9), die sich einem Elternteil zuordnen lassen.

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Funktion von Restriktionsenzymen  

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Sie spalten den DNA-Doppelstrang im Inneren und wirken wie biochemische Scheren Sie sind hochspezifisch o Sie schneiden nur an bestimmten Stellen. Die Erkennungssequenz ist in sich Spiegelbildlich. o Die Basenabfolge des einen DNA-Stranges entspricht der Sequenz des komplementären Stranges in umgekehrter Richtung. (Palindrom) Sie schneiden den DNA-Strang glatt, oder versetzt durch. o Beim versetzten Schneiden ragt an den Schnittstellen jeweils ein Stück EinzelstrangDNA heraus. Diese überstehenden Enden können sich wieder zusammenkleben (sticky ends) o Beim glatten Schneiden wird einfach durchgeschnitten. Die Enden nennt man blunt ends Sie schneiden nur die DNA, die nicht über Methylgruppen geschützt ist Das Enzym Ligase verknüpft die sticky ends, die über schwache Wasserstoffbrücken verbunden sind, mit einer stabileren Elektronenpaarbindung.

Funktion von PCR  

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Häufig stehen für DNA-Sequenzanalysen nur geringe Mengen genetischen Materials zur Verfügung. Mit der PCR lassen sich auch kleinste DNA-Proben vervielfältigen. Die PCR-Methode läuft nach dem Prinzip der DNA-Replikation ab. Sie besteht aus sich wiederholenden Schritten: 1) Denaturierung: Erwärmung auf 95°C führt zur Trennung der DNA-Doppelhelix in zwei Einzelstränge. 2) Hybridisierung: an die neiden Einzelstränge lagern sich bei 60°C zwei zuvor synthetisierte DNA-Primer an. 3) Polymerisation: beim Temperaturoptimum der Taq-Polymerase (72°C) erfolgt nun die DNA-Synthese. Dabei wird von den Primern ausgehend jeweils ein neuer Strang in 5’3’-Richtung durch die Taq-Polymerase gebildet. Durch die erneute Erwärmung (Schritt 1) wird die Replikation abgebrochen. Die DNA-Stränge liegen wieder als Einzelstränge vor und der Zyklus wiederholt sich, nach 20 Zyklen hat man über 1 Mio. DNA-Kopien.

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Funktion der Gelelektrophorese  Mit der Gelelektrophorese können Längenunterschiede von Proteinen/ DNA, durch Farbstoffe (z.B. Fluoreszenzfarbstoff), sichtbar gemacht werden.  Man gibt eine/ mehrere proben der DNA-Fragmente/ Proteine in die “Tasche” des Gels. Die Tasche besteht aus mehreren Fäden, die die Bewegung der Proben behindern. Sie bilden ein chaotisches Geflecht, durch das sich die Proben hindurchwinden müssen.  Das Gel wird eingespannt, die Taschen befinden sich an der Kathode (-), und wandern zur Anode (+). Die DNA-Proben sind negativ geladen, wegen dem Phosphat im Rückgrat. Die Proteine werden mit SDS behandelt, und sind nun auch negativ geladen.  Alle Proben werden zur Anode (+) gezogen, weil sie negativ geladen sind, wobei die längeren Stücke vom Geflecht des Gels stärker aufgehalten werden. Die Spannung wird dann abgeschaltet, wenn man die relevanten Banden unterscheiden kann.  In einer Geltasche lässt man immer ein Kontrollgemisch mitwandern, deren Fragmentlänge bekannt ist. Durch den Vergleich kann man auch die Länge der Proben abschätzen.  Um eine Sichtbare Auftrennung verschiedener Proben nach Wanderungsgeschwindigkeit zu bekommen, müssen sich die Proben deutlich in ihrer Geschwindigkeit unterscheiden.  Würde man ganze Chromosomen verwenden, so würden die Unterschiede (in der Länge) der repetitiven Sequenzen nicht ins Gewicht fallen. Repliziert man die repetitive Sequenz, dann wird der Geschwindigkeitsunterschied größer und deutlicher.  Das abschnittweise Replizieren hilft dazu, die Loci von repetitiven Sequenzen von einem Chromosom zu untersuchen. Man benutzt jeweils 2 Primer von ausreichender Länge, die selektiv so binden, dass sie die gewünschten Sequenzen einrahmen.  Das Verfahren beruht darauf, dass man einen Abschnitt der DNA vervielfältigen kann, indem man Primer wählt, die den Abschnitt vervielfältigen, sodass sich die Replikation beider komplementären Stränge überschneiden. Funktion der Protein-Gelelektrophorese 

Sie lässt sich anwenden, um verkürzte (nonsense-Mutationen) oder verlängerte Proteine (z.B. Chorea Huntington) zu erkennen.

Funktion der DNA-Gelelektrophorese  

Sie lässt sich anwenden, um die Anzahl der Repeats in nicht-codierenden Bereichen der DNA zu erkennen. Die Wiederholungen sind Vererbbar. Die Wiederholungen sind so individuell, dass man eine Person identifizieren kann, indem man seine repeat-Sequenzen zusammennimmt und mit einer Probe vergleicht.

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Neukombination von Genen mit molekulargenetischen Techniken Plasmide als Vektoren 

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Man benutzt ein passendes Restriktionsenzym, um das gewünschte Gen aus der DNA des Ursprungsorganismus herauszuschneiden. Es muss also 2 Schnittstellen geben, die dieses Gen einrahmen. o Dies kann man feststellen, indem man eine PCR der Ursprungs-DNA durchführt und dabei die Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms als Primer verwendet. Dadurch startet die PCR an der nächsten Erkennungssequenz des gewünschten Gens. Nun schneidet man mit demselben Restriktionsenzym ein Plasmid auf. Die sticky-ends des aufgeschnittenen Plasmids können sich mit den sticky-ends des herausgeschnittenen Gens komplementär binden. Mit Hilfe der Ligase werden Plasmid und herausgeschnittenes Gen zu einem ZuckerPhosphat-Rückgrat zusammengefügt.

Selektion und Vermehrung fremder DNA 

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Indem man ein Plasmid auswählt, dessen Schnittstelle (für das Restriktionsenzym) mitten im Resistenzgen liegt, verändert sich das Resistenzgen bei der Integration fremder DNA so stark, dass es keine Resistenz mehr bewirken kann. o So kann man also durch Selektion mit dem Antibiotikum Tetracyclin, die Bakterien erkennen, bei denen im Plasmid nichts passiert ist. Diese überleben als einzige Tetracyclin. Außerdem enthält das Plasmid ein Resistenzgen gegen das Antibiotikum Ampicillin, das von Restriktionsenzym nicht geschnitten wird. Wenn das Bakterium also ein Medium mit Ampicillin überlebt, hat es dieses Plasmid mit der Ampicillin-Resistenz.

Selektion von Vektoren mit Gensonden     

Man macht zuerst einen Abdruck der Petrischale mit Bakterienkolonien auf einem Nitrocellulose-Filter. Dann gibt man radioaktiv markierte Gensonden zum Filter hinzu, sodass die Gensonden dort binden können, wo sich die eingebaute Fremd-DNA (in den Kolonien) befand. Nun spült man die radioaktiven Gensonden vom Filter ab, sodass sie nur dort hängen bleibt, wo eine komplementäre Bindung ist. Radioaktiv markierte Kolonien erscheinen unter dem Röntgenfilm schwarz, da die von ihnen ausgehende radioaktive Strahlung den Röntgenfilm verfärbt. So erkennt man die Position der Kolonien, bei denen die Fremd-DNA eingebaut wurde, und kann diese vermehren.

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