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ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA – EEL/USP DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA – DEBIQ DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA – LOT2004

Estudo Dirigido em Bioquímico – Biologia Molecular

Lorena, 2019

SUMÁRIO 1.

ÁCIDOS NUCLEICOS......................................................................................................3

2.

TÉCNICAS DE IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR......................................................5

3.

4.

2.1.

Sequenciamento material genético pelo método de Sanger.....................................6

2.2.

PCR.............................................................................................................................7

2.3.

Eletroforese.................................................................................................................9

TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA.................................................................................10 3.1.

Resistência a antibióticos.........................................................................................11

3.2.

Sistema diferencial azul-branco...............................................................................11

3.3.

Eletroforese...............................................................................................................12

APLICAÇÃO DE CASO.................................................................................................13 4.1.

Passos de clonagem e transformação......................................................................13

REFERÊNCIAS.......................................................................................................................14 MATERIAL SUPLEMENTAR...............................................................................................14

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1. ÁCIDOS NUCLÉICOS

Os ácidos nucléicos são macromoléculas encontradas nas células de todos os organismos existentes e composto por nucleotídeos. A função dos ácidos nucléicos é controlar

a

síntese

protéica,

armazenamento

e

transporte

das informações

genéticas através das moléculas de DNA e RNA. Os nucleotídeos constituintes dos ácidos nucléicos são monômeros compostos por três substâncias (Figura 1): 

uma base nitrogenada;



uma pentose (glicídio composto por cinco carbonos);



uma (ou mais) molécula de fosfato.

Figura 1. Organização da molécula de nucleotídeo

Base nitrogenada

Fosfato

Pentose

Fonte: Próprio autor

Quando não há molécula de fosfato ligada na pentose e base nitrogenada, o composto é conhecido como nucleosídeo. Além

de

constituir

os

ácidos

nucléicos,

os

nucleotídeos

podem

desempenhar outras funções no interior celular, como exemplo da formação de moléculas de adenosina trifosfato (ATP) moeda de troca energética ou moléculas carreadoras de prótons gerados durante o processo de respiração celular como NAD e FAD. Existem dois tipos de ácidos nucléicos, o ácido desoxirribonucleico (DNA) e o ácido ribonucleico (RNA). Esses ácidos são grandes moléculas constituídas por unidades menores denominadas nucleotídeos, enquanto o mesmo é constituído por um

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ácido fosfórico, ligado a um monossacarídeo com cinto átomos de carbono (ácido fosfórico), que se liga com uma base nitrogenada (Figura 2). Figura 2. Estrutura das moléculas de DNA e RNA C

C

G

G

A

A

T

U

Adelina= A \ Guanina= G \ Citosina= C \ Timina= T \ Uracila= U. Fonte: Toda matéria (2018)

A pentose pode apresentar dois tipos: ribose e desoxirribose. A bases nitrogenadas ficam nas duas categorias: púricas e pirimídicas. No DNA a pentose será sempre desoxirribose (apresenta apenas uma hidroxila) e as bases nitrogenadas que podem ser encontradas são: adenina, guanina, citosina e timina, já no RNA a pentose será ribose (apresenta duas hidroxilas) e as bases nitrogenadas encontradas serão: adenina, guanina, citosina e uracila. (O DNA não apresenta uracila e o RNA não apresenta timina). O DNA, apresenta-se tipicamente encontradas em uma dupla hélice, uma estrutura na qual duas cadeias correspondentes (complementares) estão ligadas, como mostrado na Figura 2. Os açúcares e fosfatos localizam-se na parte externa da hélice, formando o arcabouço do DNA, como um esqueleto de açúcar-fosfato. As bases nitrogenadas se estendem para o interior, na qual as bases nitrogenadas complementares, par a par unem entre si por pontes de hidrogênio. As duas fitas da hélice são dispostas

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como antiparalelas, isto é, o final 5' de uma fita é pareado como final 3' de sua fita correspondente.

Figura 3. Forma molecular da molécula de DNA e RNA

Fonte: Khan Academy (2019).

O RNA, diferente do DNA, é geralmente de fita única. O fosfato na molécula de RNA se ligará a uma ribose e a uma das quatro bases nitrogenadas, porém havendo a mudança da base de timina para uracila e um grupo fosfato.

2. TÉCNICAS DE IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR

O estudo da biologia molecular representa hoje uma das áreas de maior potencial para a realização de pesquisas na área médica (com relevância clínica e epidemiológica), farmacêutica, industrial, ambiental e em pesquisa básica. Além disso, apresenta a possibilidade de aplicação de ferramentas na identificação e modelamento de respostas bioquímicas. O objetivo dos métodos de identificação moleculares apresenta a capacidade de diferenciar as relações evolutivas entre as diferentes espécies, compreender o sistema biológico, seu funcionamento e identificar as moléculas presentes na forma de seu código genético. Quando duas espécies são incluídas em uma mesma família, deve ser considerado, por inferência, que apresentem um ancestral comum. Os

métodos

moleculares

de

identificação

informam

não

só

os

desenvolvimentos evolutivos da espécie como também as características genéticas do organismo. Muitas técnicas moleculares de identificação estão disponíveis atualmente, algumas preteridas pelo alto custo, outras por serem indicadas para alguns grupos

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específicos de organismos, apresentando respostas diferentes conforme suas características, mas também conforme a sua necessidade de adequação aos métodos de identificação. Dentro do amplo aspecto das técnicas utilizadas para identificação molecular em organismos alvos, existem as mais corriqueiras, sendo elas:

2.1.

Sequenciamento material genético pelo método de Sanger Sequenciamento de DNA é o processo de determinação da sequência de bases

nucleotídicas (As, Ts, Cs e Gs) em um pedaço de DNA. Hoje em dia, com os materiais e equipamentos corretos, sequenciar um pequeno fragmento de DNA é relativamente simples. Como exemplo de técnica mais difundida, se tem a técnica do sequenciamento automático de Sanger. Nessa técnica, originalmente o ocorre a adição de nucleotídeos modificados, chamados didesoxiribonucleotídeos (ddNTPs), que não possuem o grupo OH livre do carbono 3’ da pentose, e impedem o crescimento de um fragmento de DNA em replicação. A identificação das bases nitrogenadas é possível pela presença ddNTPs distintos, quatro no total, um para cada nucleotídeo existente, cada um marcado com um corante de uma cor diferente, como demonstrado na Figura 3. Por meio da separação das cadeias truncadas, através da técnica de eletroforese me gel de poliacrilamida, se estabelece a sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA original. A caracterização completa de um fragmento de DNA clonado implica a determinação da sua sequência de nucleotídeos. Para este fim se usa normalmente o método de Sanger, o qual permite determinar a sequência exata de uma cadeia de DNA com até 500 nucleotídeos. Com

automatização das técnicas moleculares, foi possível acelerar o

sequenciamento por Sanger, possibilitando sua automação. Esse evento de automatização trocou os métodos de marcação radioativa para métodos mais simples de substituição, por meio de técnicas de marcação fluorescente (eliminando danos à saúde decorrentes do uso de nucleotídeos radioativos). A ordem em que os diferentes fragmentos passam pelo detector de fluorescência indica a sequência da cadeia de DNA complementar à cadeia usada como molde, ou seja, a sequência obtida não é a da cadeia molde, mas sim a da sua cadeia complementar.

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Embora os genomas sejam agora tipicamente sequenciados usando outros métodos mais rápidos e baratos (considerando as devidas proporções), o método Sanger ainda é amplamente usado para o sequenciamento de fragmentos individuais de DNA, como fragmentos usados na Clonagem de DNA ou gerados pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).

Figura 3. Processo de sequenciamento do DNA pelo método de Sanger

Fonte: Khan Academy (2019).

2.2.

PCR A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica usada para fazer

muitas cópias (milhões ou bilhões) de uma região específica do DNA. Essa região do DNA pode ser qualquer objeto de interesse do pesquisador. Por exemplo, pode haver um gene cuja função o pesquisador queira compreender ou um marcador genético usado pelos cientistas forenses para correlacionar o DNA da cena do crime com os suspeitos. A técnica de PCR é dependente de alguns fatores importantes para o processo de clonagens dos fragmentos alvo, são eles:



DNA polimerase termoestável (Taq polimerase) responsável pela adição dos nucleotídeos;



Primers de DNA alvo – específico para região alvo da ampliação;



Íons de Mg2+ - co-fator enzimático da Taq polimerase;



DNA molde – informação genética ou gene que se deseja amplificar;

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

Água – solvente das reações enzimáticas;



Tampão – manutenção do pH;



dNTPs –

nucleotídeos sintéticos que serão adicionados nas novas fitas

sintetizadas. Na PCR, a reação é repetida ciclicamente através de uma série de alterações de temperatura, o que possibilita a produção de muitas cópias da região de interesse. A PCR tem muitas aplicações práticas e em pesquisa. Ela é rotineiramente usada em clonagens de DNA, diagnósticos médicos e análises forenses de DNA. Mas como ocorre o processo de PCR? A técnica de PCR é realizada através de sucessivas reações cíclicas produzindo a cada rodada copias da fita molde inserida, de forma exponencial. O processo é realizado através da amplificação de uma informação dada (fita molde) por meio do reconhecimento desse fragmento por pequenas sequencias construídas, os chamados primers (Figura 4) e sucessivas reações enzimáticas. Figura 4. Reconhecimento do fragmento alvo

Fonte: Khan Academy (2019).

O processo de amplificação por PCR é dividido em 3 etapas distintas e bem definidas, são elas: 

Reação de desnaturação do DNA - ocorrendo o rompimento das pontes de hidrogênio das cadeias de fita dupla do DNA, permitindo a abertura da fita (Figura 5A);



Reação de anelamento dos primers – momento da reação em que os primers são ligados as fitas moldes (Figura 5B);

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Reação de extensão da fita de DNA – polimerase começa a adicionar os dNTPs



as cadeias formando as fitas complementares aos fragmentos alvo (Figura 5C). Figura 5. Etapas do processo de amplificação da PCR

A

B

C

Fonte: Khan Academy (2019)

2.3.

Eletroforese A eletroforese é uma técnica para separar fragmentos de DNA (ou outras

macromoléculas, como o RNA e proteínas) com base no tamanho e carga. Tem como princípio, a separação das moléculas de interesse em um gel, por meio de correntes elétricas. A separação dos fragmentos de DNA ou RNA ocorrem em função de seu tamanho e carga, as moléculas vão se mover através do gel em diferentes direções ou em diferentes velocidades, o que permite que sejam separadas umas das outras (Figura 6). Através do uso da eletroforese, podemos ver quantos diferentes fragmentos de DNA estão presentes em uma amostra, e o quão grandes eles são em relação aos outros. Podemos também determinar o tamanho absoluto de um pedaço de DNA examinando-o ao lado de um DNA “padrão”, composto de fragmentos de DNA de tamanhos conhecidos.

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Figura 6. Técnica de eletroforese em gel

Fonte: Embrapa trigo (2001).

3. TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA

Com o advento da Engenharia Genética (Biologia Sintética), ferramentas de manipulação genéticas se tornaram possíveis e passíveis de realizações em larga escala de produção. A transformação genética, passo importe dos processos de melhoramento genético, apresentam como objetivo a introdução controlada de um gene no genoma de uma célula receptora e em sua posterior expressão (apresente atividade do gene alvo inserido). A transformação genética ocorre pela inserção do gene alvo em vetores que possibilitem esse processo de clonagem, são eles chamados de plasmídeos (Figura 7). Para que ocorra esse processo de transformação é necessário que haja a possibilidade de se realizar “cortes” para a retirada da informação alvo, ocorrendo através de enzimas específicas, chamadas de enzimas de restrição. Dessa forma, para a realização da transformação são necessários alguns procedimentos, são eles:  Isolamento de gene de interesse – etapa na qual se identifica o gene alvo e o “recorta” do DNA, utilizando enzimas de restrição;  Inserção do gene alvo – etapa na qual será infundido o fragmento alvo ao vetor de clonagem através da DNA ligase, formando o plasmídeo recombinante contendo o gene de interesse.

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Figura 7. Processo de clonagem do gene alvo

Fonte: Khan Academy (2019).

No processo de transformação genética, é importante lembrar que nem todas as células sofreram as modificações desejadas, apresentando apenas uma pequena margem de células com integração do gene alvo exógeno. Mas então como saber quais células foram transformadas e receberam o gene alvo de interesse? Nesse aspecto, técnicas de screening foram desenvolvidas para facilitar o processo de identificação de células transformantes. As técnicas mais utilizadas são:

3.1.

Resistência a antibióticos

São selecionados plasmídeos que apresentam como característica a resistência a algum antibiótico específico. Dessa forma, ao inserirmos a informação alvo no plasmídeo, o organismo que apresentar resistência, ou seja, sobreviver ao crescimento em meios contendo o antibiótico, terá recebido o plasmídeo. 3.2.

Sistema diferencial azul-branco

A técnica de resistência a antibiótico apresenta muita utilidade para se ter noção da margem de células que receberam o plasmídeo recombinante. Porém, alguns destes plasmídeos podem no meio do processo de transformação, simplesmente voltarem ao formato original, dando a falsa impressão de transformação e clonagem, pois confere ao

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micro-organismo a resistência ao antibiótico (IMPORTANTE LEMBRAR, A RESISTENCIA DO PLASMÍDEO E NÃO DO MICRO-ORGANISMO). Por esse motivo, alguns plasmídeos foram desenvolvidos com a presença de mais de um marcador de seleção, como exemplo dos plasmídeos da série pUC, que possuem um gene (gene lacZ) que codifica a produção da enzima β-galactosidase, que quando em meio suplementado com X-gal, apresenta a formação de colônias bacterianas azuis. Quando ocorre a inserção do fragmento alvo ao plasmídeo de clonagem do plasmídeo ocorre a interrupção do gene, levando à perda da função da βgalactosidase, promovendo a formação de colônias bacterianas brancas, como mostrado na Figura 8. Figura 8. Seleção de recombinante azul-branco

3.3.

Eletroforese

Através da separação do material genético é possível a verificação das informações desejadas. Como exemplo, por meio da eletroforese é possível a visualização da inserção do material genômico, gene de interesse alvo e do plasmídeo utilizado para processo de clonagem, sendo possível a verificação da presença da correta inserção do gene, bem como o próprio sentido de colocação do gene, forma horário (positivo) como anti-horária (negativo). 4. APLICAÇÃO DE CASO Suponha que você tenha acabado de fazer uma reação de PCR, criando várias cópias de uma região de interesse do DNA. Ou talvez você tenha feito uma clonagem de

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DNA, tentando "colar" um gene em um plasmídeo (DNA microbiano em forma circular). Quais os passos seriam adotados para o procedimento de transformação genética?

4.1.

Passos de clonagem e transformação

Figura 9. Etapas do processo de transformação gênica

Fonte: Blog do Prof Djalma Santos (2011)

1. Identificação e obtenção do gene de interesse; 2. Desenhar primers com sítio de restrição nas extremidades; 3. PCR com os primers e gene de interesse; 4. Identificação e obtenção (extração de DNA plasmidial do vetor de clonagem (vetor contendo gene de resistência a antibiótico + sítio de restrição + gene marcador); 5. Digestão do vetor com as enzimas de restrição, compatíveis com o DNA de interesse; 6. Ensaio contendo o vetor digerido + gene de interesse + DNA ligase; 7. Selecionar possíveis células de clonagem, geralmente cepas de E.coli específicas; 8. Inserção do plasmídeo recombinante em células de clonagem por transformação via choque térmico ou eletroporação;

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9. Ensaio in vitro para testar o gene marcador (ex: lacZ) + indutor (IPTG) e selecionar possíveis recombinantes, em meio contendo antibiótico; 10. Realização de um screening para verificação da eficácia de clonagem através de separação por eletroforese ou sequenciamento pelo método de Sanger (requer a digestão prévia dos plasmídeos).

REFERÊNCIAS CAMPBELL, M. K.; FARRELL, S. O. Bioquímica: Volume 2, biologia molecular. Tradução da 5ª edição norte-americana por All Tasks; revisão técnica Maria Martha Guedes Chaves. – São Paulo: Thomson Learning, 2007. 268p. NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica de Lehninger, 5ª edição. São Paulo: Editora Artmed, v. 6, 2011. ZAHA, A.; FERREIRA, H. B.; PASSAGLIA, L.M.P. Biologia Molecular Básica-5. Artmed Editora, 2014. ALBERTS, B. JOHNSON, A.; LEWIS, J.; MORGAN, D.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, P.; HUNT, T. Biologia molecular da célula. Artmed Editora, 2010.Biologia molecular da célula. Artmed Editora.

MATERIAL SUPLEMENTAR

Sequenciamento de Sanger - https://www.youtube.com/watch?v=Uma54mKcR40 https://www.youtube.com/watch?v=AI4CnG5Jp4s PCR - https://www.youtube.com/watch?v=-gB2WC9rUAI Eletroforese - https://www.youtube.com/watch?v=93a_m4wS2bM Transformação genética - https://www.youtube.com/watch?v=zUdwMiRo8zE Enzimas de restrição - https://www.youtube.com/watch?v=oAG8jBeHff8 (parte 1) https://www.youtube.com/watch?v=ZtB59MlTOfU (parte 2)...