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Vectores Plásmidos o Vectores Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Vectores de clonado, son pequeñas moléculas de ADN, con capacidad autoreplicativa. Se introducen dentro de la célula hospedadora y en general, producen un gran numero de copias. Vectores de expresión, poseen toda la...

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Vectores Plásmidos o Vectores Son moléculas pequeñas de ADN doble cadena y circular. Vectores de clonado, son pequeñas moléculas de ADN, con capacidad autoreplicativa. Se introducen dentro de la célula hospedadora y en general, producen un gran numero de copias. Vectores de expresión, poseen información necesaria para expresar una aminoacídica.

toda la secuencia

Vectores de clonado PLASMIDOS: moléculas de DNA doble cadena y circular que se encuentran en bacterias y se replican en forma independiente del cromosoma

Características: • Son pequeños (miles de pares de bases) • Son circulares • Tienen un único origen de replicación • Sitios únicos de clivaje para enzimas de restricción • Gran numero de copias • Marcadores que permitan su reconocimiento

Características generales de los vectores de clonado: Sitios de restricción únicos

mcs Marcadores genéticos

(permiten selección de transformantes)

Orígen de replicación

pBR322 4361 bp

Tamaño pequeño

(mayor eficiencia de transformación)

Vectores de expresión eucariotas Origen de replicación ( ori ): necesario para la replicación del vector dentro del organismo hospedador.

Promotor: Sitio de unión de RNA polimerasa. Elementos promotores

Promotor

Tata Box

Constitutivos: SV40, RSV, CMV, hEF-1a Inducibles: Tet o T-Rex inducilbe por tetraciclina Olac inducible por IPTG Metalotioneína inducible por metales pesados GAL4-E1b inducible por mifepristona

Vectores de expresión eucariotas Origen de replicación ( ori ): necesario para la replicación del vector dentro del organismo hospedador.

Promotor: Sitio de unión de RNA polimerasa. Terminador: Sitio de terminación de la transcripción. Sitio de unión a ribosomas: se une la subunidad menor del ribosoma en el momento de iniciarse la traducción (Secuencias Kozak y codón ATG).

Sitio de clonado múltiple (MCS): Región del vector que posee varias secuencias compatibles con sitios de corte de enzimas de restricción.

Factor de selección: Codifica el/los marcador/es de selección que permita diferenciar células transformadas.

Otras características: secuencias codificantes para fusion-tag, His-tag, péptido señal de localización periplasmatica, etc.

Segmentos de DNA para recombinación homóloga (para transfecciones estables).

Vectores de expresión eucariotas

Resumiendo.....

k

Obtención de grandes cantidades del plásmido para su posterior transfección a células eucariotas.

Clonado de PTP1B en el vector de expresión eucariota pGFP-N1 PTP1B pGFP-N1

Transfección de células eucariotas

• Se usa el término Transfección para

denominar la entrada de DNA foráneo a las células eucariotas mediante métodos químicos o físicos.

• Se denomina Infección a la introducción

de DNA foráneo dentro de las células eucariotas mediante la utilización de moleculas virales.

Objetivos de la transfección - Expresión de proteínas para su purificacón. - Expresión de proteínas para estudiar su efecto sobre el fenotipo celular. - Estudio de promotores y elementos regulatorios. - Estudio de mecanismos involucrados en el procesamiento del RNA, postraduccionales, etc. -Estudio de interacción de proteínas.

- Estudio de localizacion subcelular de proteínas. - Terapia génica.

Transfección: proceso por el cual un gen de interés es introducido dentro de la célula eucariota por métodos químicos y físicos.

Métodos químicos: DEAE-Dextrano Coprecipitados de Fosfato de calcio Lípidos cationicos (Liposomas)

Métodos físicos: Biobalística Microinyección Electroporación

Métodos químicos

Métodos Físicos Electroporación

Microinyección

Biobalistica

Métodos Físicos Biobalistica

Resumen Liposomas

alta eficiencia, no-tóxico, estables

Fosfato de calcio

simple, baja eficiencia, no para estable

DEAE-dextrano

simple, alta efiencia, no para estable,toxico para algunas líneas celulares

Electroporación

alta eficiencia, altos niveles de muerte

Microinyección

laborioso, alta eficiencia

Biobalística

baja eficiencia, muy costosa, se han logrado buenos resultdos solo para células vegetales

Transfección estable y transiente

Transfección estable

• Por integración • Por recombinación homóloga • Requiere de un marcador de selección en

el vector

• Util para estudios que impliquen inducción

de la expresión

Transfección estable y transiente

Transfección transiente (48 a 72 horas)

 Análisis rápido  Múltiples propósitos  Análisis de secuencias regulatoria

Consideraciones para transfección con lípidos cationicos Tansfección en presencia de suero Antibióticos en el medio de cultivo Densidad celular Elección del promotor Cantidad de DNA

Infección: proceso mediado por una molécula viral donde la células target son infectadas con un virus que lleva clonado la secuencia de interés en su genoma.

Ejemplos: Vaccinia Semmliky Baculovirus...