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- UE Bases Moléculaires – Glycosylation - 07/12/2017 BMCP – cours n°1 – Bekri – 07/12/17

Glycosylation et CDG syndromes C’est une modification post ou co-traductionnelle. Mais le plus souvent elles sont post traductionnelles. Dans tous les cas on les appelle post-traductionnelles. Dans le noyau, l’ADN va être transcrit en ARN. L’ARN va sortir du noyau et aller dans le RE, ceci va aboutir à la formation d’un polypeptide. Les modifications post-traductionnelles peuvent avoir lieu soit dans le RE, soit dans l’appareil de Golgi. Elles permettent à la protéine d’être fonctionnelle et servent à la régulation en révélant les anomalies. Une protéine peut avoir différentes fonctions suivant la modification (on sort du dogme « un gène = une fonction ») Une des voies majeures de ces modifications post-traductionnelle est la glycosylation. La glycosylation a une régulation très fine. 60 à 70% de toutes nos protéines sont glycosylées. 012 Programme majeur :  Programme de contrôle qualitatif et quantitatif des protéines  Plusieurs sites peuvent être concernés et plusieurs modifications peuvent se faire  Plusieurs modifications : glycosylation (ajout de sucres), sulfations, acétylation, phosphorylation, ubiquitinylation  Nécessite plusieurs enzymes spécialisées espèces et tissus spécifiques. Ces modifications modulent : - Les propriétés physicochimiques de la protéine. Ex : perte de l’acidité. - Le repliement et la conformation de la protéine et donc une modification de l’adressage vers son site final - La stabilité de la protéine - La distribution dans la cellule (ex : enzymes lysosomales adressées au lysosome grâce à un mannose 6 P) - L’activité enzymatique de la protéine - L’immunogénicité Dans le cas d’une glycosylation : Il y a une liaison covalente d’un ou de plusieurs monosaccharides à un peptide. 41 liaisons sucres-peptides identifiés, 13 monosaccharides et 8 AA y participent. Plusieurs types dont deux principaux : - N-glycosylation (majorité) : fixation sur l’asparagine (75%) et l’arginine sur un atome d’azote - O-glycosylation : fixation sur un groupement OH (les deux AA les plus impliquées sont la sérine et la thréonine) La biosynthèse des protéines glycosylés suit 3 étapes : 1. Les monosaccharides activés sont formés dans le cytoplasme 2. Les monosaccharides activés sont transportés dans le Réticulum Endoplasmique et l’Appareil de Golgi 3. Les glycosyls transférases attachent les monosaccharides activés entre eux puis à la protéine ou à la chaine oligosaccharidique (s’il y a déjà des monosaccharides attachés)

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I. N-GLYCOSYLATION

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Liaison d’un Asn (asparagine) à un N-acétylglucosamine Le résidu Asn se trouve dans une région consensus Asn-X-Ser/Thr (où X peut être tous les AA sauf la proline). C’est un site probable de N-glycosylation.

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Synthèse concomitante (modif co-traductionnelle) de la chaine peptidique et de la chaine oligosaccharidique dans le RE : les monosaccharides sont d’abord activés dans le cytosol sous forme d’UDP (N-acétylglucosamine) ou GDP (mannose) puis sont ajoutés séquentiellement sur une ancre lipidique, le dolichol-phosphate, inséré dans la membrane du RE Les 7 premières réactions (2 N-acétyglucosamine et 5 mannose) se passent dans la partie cytosolique du RE Une enzyme la flippase est responsable de la translocation des oligosaccharides synthétisés sur la face cytosolique du RE vers la lumière du RE Ajout d’autres monosaccharides dans la lumière du RE et utilisent le dolichol-phosphate mannose et dolichol-phosphate glucose comme donneurs On arrive à un oligosaccharide appelé LLO (Lipid Link Oligosaccharide) qui est la forme finale commune à toutes les N-glycosylations Le LLO est transféré par des « oligosaccharyl transférase » sur l’Asn du site consensus

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La maturation des N-glycanes démarre dans le RE avec le clivage séquentiel de 3 résidus glucose et d’un résidu mannose (glucosidase I et II et mannosidase I) et se poursuivra dans le Golgi

A savoir : une grande partie de ces oligosaccharides vont se terminer par un acide sialique qui est important pour un certain nombre de fonctions. Les liaisons (1-3 ou 1-6) de l’acide sialique sont très spécifiques. Ex : la liaison 1-6 est très spécifique de l’homo sapiens. L’acide sialique correspond en fait au NANA (N-acétylneuraminique) et tous ses dérivés. Cette spécificité est à l’origine de réactions immunitaires si les protéines sont synthétisées dans un organisme étranger.

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II. LA O-GLYCOSYLATION Tous les AA ayant une fonction OH peuvent être engagés dans une liaison O-glycosidique (Ser, Thr, Tyr, Hydroxyproline et hydroxylysine), les plus fréquents sont Ser et Thr. Les O-glycosylations (mise à part la O-N-acétylglucosamino-glycosylation) prennent place dans le RE après synthèse. Oligomérisation et repliement de la protéine ou dans l’AG. Plusieurs O-glycosylations existent (diversité beaucoup plus importante que N-glycosylation) : - N-acétylgalactosamine O-glycanes - N acétylglucosamine O-glycanes - O-galactosylation - O-fucosylation - O-mannosylation - O-glucosylation - O-glucosaminoglycane-type glycosylation  Le nom correspond au premier sucre apposé sur la chaine

a. N-acétylgalactosamine O-glycanes LA liaison O-N-acétylgalactosamine – Ser/thr est la plus abondante et est retrouvée dans les mucines (molécules fortement glycosylées ayant une fonction de protection des épithéliums digestif et pulmonaire : mucus). L’oligosaccharide est de taille limité (1 à 10), il existe 8 structures différentes. Dans la mucoviscidose on a une modification de la fluidité du mucus qui l’empêche d’être évacué et provoque des infections pulmonaires. De même si on a une modification de la fluidité du mucus du pancréas, on a une difficulté à transférer les enzymes vers le tube digestif.

b. N-acétylglucosamine O-glycanes Contrairement aux autres glycosylations qui prennent place dans le RE et l’AG et qui sont stables (restent présentes au cours de la vie de la molécule), la liaison O-N-acétylglucosamine –Ser/Thr est une modification dynamique et réversible qui peut avoir lieu dans le cytoplasme et le noyau de la cellule. Elle n’est pas stable. La O-N-acétylglucosamino-glycosylation agit comme la phosphorylation sur l’activité des protéines et les interactions protéine-protéine. Deux enzymes contrôlent de manière très dynamique le niveau de O-N-acétylglucosamino-glycosylation des protéines : - OGT (O-linked N-acétyl-glucosaminyltransférase) - OGA (N-acétyl-ß-D glucosaminidase) On dit que la régulation est fine et dynamique.

c. O-galactosylation Retrouvé uniquement dans le collagène, des résidus galactose (Gal) ou Clc-gal sont liés de façon covalente à des résidus hydroxylysine

d. O-fucosylation Des motifs O-fucosylés sont retrouvés dans des protéines ayant un rôle dans la coagulation (facteur VII, facteur XII et l’activateur tissulaire du plasminogène tPA)

e. O-mannosylation Retrouvée dans des protéines cérébrales et musculaires. Exemple : alpha-dextroglycane

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Biosynthèse dans le RE puis transfert du mannose du dolichol phosphate mannose au résidu Ser/Thr. Un déficit de cette glycosylation provoque une dextroglycanopathie.

f. O-glucosylation EGF (facteur de croissance de l’épiderme) et les protéines contenant des séquences répétées « EGF-like » (facteur VII, facteur IX, protéine Z et thrombospondin) sont glucosylés au niveau des sites consensus pour une modification O-glucose : C1XSXPC2 (C1 et C2 sont des cystéines conservées)

g. O-glucosaminoglycane glycosylation Glucosaminoglycanes (GAG) : chaines polysaccharidiques non branchées composées d’une répétition d’unités disaccharidiques. Contrairement aux autres, la partie protéique est très réduite et la partie saccharidique est très importante. Protéoglycanes : protéines contenant des GAG liés à un résidu Ser (O-glycosylation) par un tétrasaccharide.

III. CDG SYNDROMES Les protéines glycosylées représentent plus de 60% du protéome  une anomalie de la glycosylation a souvent des conséquences multisystémiques avec un phénotype sévère. Elles sont appelées anomalies congénitales de la glycosylation (CDG en anglais) Maladies autosomiques récessives Incidence estimée à 1/20000 – 1/50000 naissances  Toutes les étapes précédemment décrites peuvent être déficitaires : - Activation des monosaccharides - Transport des monosaccharides activés - Déficit des glycosyltransférases - Déficit des glucosidases

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a. Déficit de la N-glycosylation Subdivisés en 2 parties : - Déficit de la synthèse de LLO : CDG I (Tout ce qui se passe dans le RE) => retard mental, épilepsie, dysmorphie, atteinte viscérale… - Déficit de la maturation de l’oligosaccharide : CDG II (Tout ce qui se passe dans le Golgi) => tableaux cliniques très variables (retard psychomoteur, dysmorphie, périmètre crânien, hépatique, convulsion) Ancienne classification : CDG I et CDG II Nouvelle classification depuis 2009 : Nom du gène suivi de CDG

b. Déficit de la O-glycosylation Groupe très hétérogène, peuvent ne toucher qu’un tissu Exemple : défaut de synthèse GAG et malformations squelettiques

c. Déficits de la N et O-glycosylation Intéressent les étapes communes aux deux types de glycosylation

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IV. MOYENS D’ÉTUDES DES CDG a. Moyens d’étude de la N-glycosylation Au début on utilisait une isoélectrofocalisation, puis la technique a été remplacée par une électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE), suivie d’un transfert sur nitrocellulose et d’une révélation par un anticorps spécifique (Western Blot). On fait migrer les protéines grâce à leur poids moléculaire puis on les reconnait avec un anticorps.  Changement de la masse moléculaire relative liée à la perte des chaines glycanes. Etude de 4 protéines, hautement glycosylées : haptoglobine, orosomucoïde, alpha1-anti-trypsine et transferrine. Diagnostic de CDGI et CDG Iia Méthode d’étude actuelle : spectrométrie de masse. Plus on précise le poids moléculaire, puis on augmente la précision de l’étude jusqu’à être capable parfois d’identifier molécule par molécule (attention parfois sur un même poids moléculaire il y a plusieurs conformations spatiales). Permet de mettre en évidence s’il y a un problème ou non mais ne permet pas forcément de l’identifier. Pour préciser le sous groupe  mettre en évidence l’enzyme faisant défaut. 

Etude sur fibroblastes du LLO : mannose marqué, extraction du LLO et analyse HPLC. Mise en évidence de chaines oligosaccharidiques raccourcies. Ces études sur fibroblastes ont été très importantes à un moment, on pourrait maintenant s’en passer.

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Etudes des activités enzymatiques notamment phosphomannomutase (PMM2) et phosphomannose isomérase (MPI)

 Etude moléculaire. Avant la biologie moléculaire était une étape de confirmation finale, maintenant on est en train d’inverser et de la faire en priorité.

b. Moyens d’étude de la O-glycosylation Tous les déficits de la O-glycosylation ne peuvent être détectées par une seule analyse. IEF (Isoélectrofocalisation) de l’APO CIII permet d’explorer la O-glycosylation mucine. C’est une méthode qui est abandonnée au profit de la spectrométrie de masse.

V. EX DE CDG : PMM2-CDG (CDG-IA) Déficit en phosphomannomutase qui permet la synthèse de mannose-1-phosphate à partir du mannose-6phosphate. Plusieurs tableaux cliniques - Forme précoce multisystémique (néonatale, c’est la forme classique, la plus fréquence, généralement détectée) - Forme infantile avec ataxie et retard mental - Forme adulte - Forme prénatale

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a. Forme précoce multisystémique Néonatale, c’est la forme la plus fréquence : atteinte neurologique et viscérale. Il y a deux points sensibles orientant le diagnostic (en gras) - Hypoplasie cérébelleuse - Hypotonie axiale - Hyporéflexie - Retard psychomoteur - Dysmorphie faciale - Atteinte oculaire avec strabisme - Mamelons inversés - Retard de croissance - Troubles de la coagulation - Troubles hormonaux - Atteinte hépatique avec cytolyse - Déficit immunitaire - Épilepsie, atteinte rénale, atteinte cardiaque - Peau en orange : lorsqu’on appuie sur le fessier ça fait comme des vergetures chez l’adulte. Montre une distribution anormale des graisses sous-cutanées. Ce sont souvent des enfants qui décèdent rapidement par hémorragie (entre autres).

b. Forme infantile Forme probablement sous-détectée. Présente une ataxie et un retard mental. - Débute entre 3 et 10 ans - Hypotonie et ataxie - Retard de langage - QI entre 40 et 70 - Parfois épilepsie

c. Forme adulte Signes de la forme classique mais atténués. Sous-diagnostiqué. - Retard mental non progressif - Neuropathie périphérique variable - Parfois ataxie - Déformation thoracique et vertébrale - Hypogonadisme chez la femme - Troubles hormonaux - Coagulopathie - Parfois kystes rénaux

d. Forme prénatale Anasarque foeto-placentaire, ce sont des œdèmes généralisés du fœtus, la forme n’est pas (ou peu) viable.

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VI. EX DE CDG : MPI-CDG (CDG IB) Déficit en phosphomannose isomérase qui catalyse la première étape de la synthèse du GDP-mannose Pas ou peu d’atteinte neurologique  Atteinte hépato-digestive - Diarrhée, vomissement, entéropathie exsudative - Hépatomégalie, cytolyse, fibrose, stéatose, cirrhose, IHC  Hypocholestérolémie  Hypoglycémies  Atteinte rénale  Déficit immunitaire  Coagulopathie Seul CDG traitable efficacement par administration orale de mannose 1g/kg/j en 4 à 6 prises. L’hexokinase phosphorylase permet la phosphorylation du mannose et contourne ainsi le déficit enzymatique.

VII. AUTRES CDG-I -

Retard mental Épilepsie Dysmorphie Parfois atteinte viscérale

VIII. CDG II (APPAREIL DE GOLGI) Tableaux cliniques très variables - Retard psychomoteur - Dysmorphie - Modification du périmètre crânien - Atteinte hépatique - Convulsions

IX. DÉFICIT DE LA O-GLYCOSYLATION Plus de 30 pathologies décrites touchant toutes les voies métaboliques citées. Tableau spécifique pour chaque déficit de O-glycosylation

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