Capitolo 16 - Ciclo dell\'acido citrico PDF

Preview

Summary

Ciclo dell'acido citrico...

Description

CICLO DELL’ACIDO CITRICO: La glicolisi è solo la prima fase della completa ossidazione del glucosio. Invece di essere ridotto a lattato etanolo o altro, il piruvato prodotto dalla glicolisi viene ulteriormente ossidato in H2O e CO2. Questa fase aerobica del catabolismo è chiamata respirazione. La respirazione cellulare si svolge in tre fasi principali: nella prima le molecole organiche come glucosio e acidi grassi vengono ossidati per produrre frammenti a due atomi di carbonio, nella forma del gruppo acetilico legato al coenzima A; nella seconda fase i gruppi acetilici entrano nel ciclo di krebs che li ossida formando CO2, e l’energia liberata viene ossidata sottoforma di NADH e FADH2; nella terza fase i coenzimi ridotti vengono ripssidati a NAD e FAD liberando elettroni sottoforma di ione idruro. Gli elettroni vengono trasferiti all’ossigeno tramite la catena respiratoria. Consideriamo dapprima la conversione del piruvato in gruppi acetilici e l’entrata di questi nel ciclo dell’acido citrico. Produzione dell’acetil-CoA (acetato attivato): negli organismi aerobici, il glucosio gli acidi grassi e la maggior parte degli amminoacidi, sono ossidati a CO2 e H2O attraverso il ciclo dell’acido citrico e la catena respiratoria. Prima di poter entrare nel ciclo, lo scheletro carbonioso di questi composti deve essere degratato a gruppo acetilico del Co-A. Analizziamo ora come l piruvato che deriva dalla glicolisi viene ossidato in CO2 e H2O ad opera di un gruppo di tre enzimi organizzati nel complesso della piruvato deidrogenasi presenti nei mitocondri delle cellule eucariote. Al meccanismo di queste reazioni partecipano 5 cofattori. Il piruvato viene ossidato ad acetil Co-A e CO2: La reazione complessiva della piruvato deidrogenasi è una decarbossilazione ossidativa, un processo di ossidazione irreversibile in cui un gruppo carbossilico viene rimosso dal piruvato sotto forma di CO2, i due atomi di carbonio che restano del piruvato formeranno il gruppo acetilico del Co-A. il NADH formato da questa reazione porta uno ione idruro con due elettroni , alla catena di trasporto degli elettroni che li trasporta a sua volta all’ossigeno. Il trasferimento di due elettroni all’ossigeno produce 2,5 molecole di ATP

Il complesso della piruvato deidrogenasi richiede cinque coenzimi distinti: la deidrogenazione e la decarbossilazione combinata del piruvato in acetil-CoA coinvolge 3 enzimi diversi e 5 coenzimi/gruppi prostetici: la tiamina pirofosfato(TTP), la flavin adenin dinucleotide(FAD), il coenzima A , il nicotinammide adenin dinucleotide (NAD) ed il lipoato. Ben quattro vitamine devono essere assunte con l’alimentazione e fanno parte di questi composti: la tiamina, la riboflavina (FAD), la niacina (NAD) e il pantotenato(coA). Il coenzima A ha un gruppo reattino tiolico SH-, essenziale per la sua funzione per la sua funzione di trasportatore di gruppi acilici. Il legame che si forma tra SH e gruppo acilico è un legame tioestere. I tioesteri hanno un elevato potenziale di trasferimento.

Il quinto cofattore della reazione della piruvato deidrogenasi, il lipoato, ha due gruppi tiolici che possono essere ossidati a in modo reversibile a formare un pponte disolfuro (S-S). il lipoato può servire sia come trasportatore di elettroni che di acili.

Il complesso della piruvato deidrogenasi è costituita da tre enzimi distinti: la piruvato deidrogenasi, la diidrolipoil transacetilasi e la diidrolipoil deidrogenasi, rispettivamente sono E1 E2 ed E3. Il sito E1 contiene TTP, E3 contiene il FAD, E2 contiene tre domini distinti: dominio lipoil amminoterminale, dominio centrale di legame di E1 ed E3 ed il dominio interno acetiltrasferasico.

Durante l’incanalamento dei substrati gli intermedi non abbandonano mai la superficie dell’enzima; Tappa 1: è essenzialmente identica alla reazione catalizzata dalla piruvato decarbossilasi, l’atomo C1 del piruvato viene rilasciato sottoforma di CO2, e il C2 del piruvato viene legato alla TTP come gruppo idrossietilico. Tappa 2: il gruppo idrossietilico viene ossidato a livello di acido carbossilico, ed i due elettroni rimossi dalla reazione vanno a ridurre il ponte S-S nell’E2 formando due gruppi tiolici SH SH. Tappa 3: Il residuo acetilico prima viene esterificato su un gruppo SH e poi transesterificato a formare acetilCoA.

Le tappe 4 e 5 sono una serie di trasferimenti elettronici necessari a rigenerare la forma ossidata a disolfuro(ponte disolfuro) del gruppo lipoilico E2 e quindi a preparare il complesso per un nuovo ciclo di ossidazione. gli elettroni rimossi dal gruppo idrossiletilico derivano dal piruvato e passano al NAD + transitando prima attraverso il FAD. Questa sequenza di reazioni è un esempoi si incanalamento dei substrati Reazioni del ciclo dell’acido citrico: siamo ora pronti ad esaminare il processo di ossidazione dell’acetil-coA, ossia il ciclo dell’acido citrico, la prima via metabolica ciclica che abbiamo preso in esame. Per iniziare un giro del ciclo l’acetil-coA dona il suo gruppo acetilico all’ossalacetato, un composto a 4C e formano insieme il citrato un composto a 6C. il citrato poi viene trasformato in isocitrato a 6C, esso poi viene deidrogenato con la perdita di CO2 e si forma α-chetoglutarato a 5C. quest’ultimo perde un’altra molecola di CO2 e si forma succinato a 4C. il citrato viene convertito enzimaticamente in tre tappe in ossalacetato che può iniziare nuovamente il ciclo. in ogni giro del ciclo entra un gruppo acetilico sottoforma di acetil-coA e escono due molecole di CO2. Non vi è un consumo netto di ossalacetato, una sola molecola può ossidare un numero infinito di gruppi acetilici. Quattro delle otto tappe di questo processo sono ossidazioni, la cui energia viene conservata da NADH e FADH2. Gli intermedi del ciclo sono precursori biosintetici di vari composti.

Il ciclo dell’acido citrico comprende otto tappe: nell’esaminare le otto reazioni del ciclo, porremmo un particolare accento sulle trasformazioni biochimiche a cui va incontro il citrato che si è formato dall’acetil-coA e dall’ossalacetato, quando viene osisdato per generare CO2 e l’energia di ossidazione viene conservata sottoforma di NADH e FADH2.

Tappa1 : formazione del citrato. la prima reazione è la condensazione dell’acetil co-A con ossalacetato per formare citrato. La reazione è catalizzata dalla citrato sintasi. In questa reazione il carbonio del gruppo acetilico dell’acetil-coA si lega l’atomo C2 dell’ossalacetato. L’intermedio di reazione è il citril-CoA, è un intermedio tioestere e si forma

sul sito attivo dell’enzima; va incontro ad una rapida idrolisi producendo Co-A libero e citrato. L’idrolisi dell’intermedio tioestere rende la reazione altamente esoergonica ed è molto importante per l’avanzare del ciclo. Il Co-A libero viene riciclato e può partecipare alla decarbossilazione ossidativa di un'altra molecola di piruvato. nella reazione della citrato sintasi nei mammiferi, il primo substrato che si lega è l’ossalacetato, questo legame innesca una modificazione conformazionale che apre il sito di legame per l’acetil-CoA. L’ossalacetato viene orientato specificatamente nel sito della citrato sintasi tramite l’interazione con i suoi gruppi carbossilici con due gruppi di arginina carichi del sito attivo.

Tappa2: formazione dell’isocitrato tramite il cis-aconitato: l’enzima aconitasi catalizza la formazione reversibile del citrato, in isocitrato, mediante la formazione

intermedia dell’acido tricarbossilico cis-aconitato, che normalmente non si dissocia dall’enzima. L’aconitasi può aggiungere una molecola di acqua al doppio legame dell’intermedio in due modi diversi, una via porta al citrato e una via all’isocitrato. nella cellula la reazione viene spinta verso destra per l’uso molto rapido si isocitrato da parte della tappa successiva. L’aconitasi ha un centro ferro-zolfo che agisce sia nel legame col substrato sia nell’aggiunta o rimozione di acqua. Nelle cellule in cui la concentrazione del ferro è bassa, l’aconitasi perde il suo centro ferro-zolfo ed acquisisce un ruolo nell’omeostasi del ferro.

Tappa3: ossidazione dell’isocitrato ad α-chetoglutarato. nella tappa successiva l’isocitato deidrogenasi catalizza la decarbossilazione ossidativa dell’isocitrato per formare α-chetoglutarato. Uno ione Mn2+ presente nel sito attivo interagisce col gruppo carbonilico dell’intermedio ossalosuccinato, che non lascia il sito di legame fino alla nuova conversione. Questo composto andrà incontro ad una decarbossilazione per formare α-chetoglutarato. L’Mn2+ stabilizza anche l’enolo formatosi transitoriamente.

(1)L’isocitrato viene ossidato dal trasferimento di uno ione H dal NAD+ o la NADP+

(2) La decarbossilazione viene favorita dalla sottrazione di un elettrone da parte dello ione Mn2+.

(3) Il riarrangiamento dell’intermedio enolico genere αchetoglutarato.

vi sono due differenti forme di isocitrato deidrogenasi , una richiede NAD come accettore di elettroni e una richiede NADP. Nelle cellule eucariotiche l’isozima NAD-dipendente è presente nella matrice mitocondriale e opera all’interno del ciclo dell’acido citrico. L’isozima NADP-dipendente è presente sia nella matrice che nel citosol. La sua funzione principale è quella di generare NADPH essenziale nelle reazioni anaboliche riduttive.

Tappa 4: ossidazione dell’ α-chetoglutarato a succinil co-A e CO2. questa tappa è un’altra decarbossilazione ossidativa e avviene ad opera del complesso α-chetoglutarato

deidrogeasi. Il NAD+ è l’accettore di elettroni e il Co-A è il trasportatore del gruppo succinile. L’energia liberata dall’ossidazione è conservata nel legame tioestere del succinil co-A. Questa reazione è praticamente identica alla reazione catalizzata dal complesso della piruvato deidrogenasi. Anche in questo complesso sono presenti tre enzimi analoghi ad E1, E2 ed E3 e cinque coenzimi; TTP legato al ptimo enzima, lipoato al secondo, FAD , NAD e coenzima A. entrambi i complessi enzimati derivano da un gene ancestrale comune.

Tappa 5: conversione del succinil-CoA a succinato. Il succinil-CoA ha un legame tioestere con un energia di idrolisi libera fortemente negativa. La rottura di questo legame tioestere provoca la formazione di un legame fosfoanidrilico sottoforma di GTP o ATP. Il processo porta alla formazione di succinato. L’enzima che catalizza questa reazione è la succinil co-A sintetasi. In questa reazione che conserva energia, vi è una fase intermedia in sui la molecola dell’enzima diventa fosforilatra a livello di His del suo sito attivo. Il gruppo fosforico che ha un elevato potenziale di trasferimento viene quindi trasferito all’ADP per formare ATP. L’enzima ha due subunità: la subunità α possiede l’enzima di his fosforilato ed il sito di legame del Co-A, la subunità β conferisce la specificità per l’ATP o per il GTP. La formazione di ATPo GTP a spese dell'energia rilasciata dalla decarbossilazione ossidativa è una fosforilazione a livello del substrato. Il GTP formato dal succinil co-A sintetasi può donare il gruppo Pi terminale all’ADP per formate ATP. Quindi il risultato di entrambi gli isozimi della succinil-coA sintasi è la conservazione di energia sottoforma di ATP. Tappa 6: ossidazione del succinato in fumarato. la reazione è catalizzata dalla flovoproteina succinato deigrogenasi, negli eucarioti essa è saldamente legata alla membrana interna dei mitocondri, contiene tre diversi centri ferro-zolfo euna molecola di FAD legata covalentemente. Gli elettroni estratti dal succinato passano attraverso il FAD e i centri ferro-zolfo prima di entrare nella catena di trasporto degli elettroni. Il flusso degli eletroni attraverso questi trasportatori fino all’ossigeno è accoppiato alla sintesi di 1,5 molecole di ATP. Il malonato è un forte inibitore competitivo della succinato deidrogenasi , se aggiunto ai mitocondri blocca il ciclo dell’acido citrico.

Tappa 7: Idratazione del fumarato a malato. l’idratazione reversibile del fumarato a l-malato, è catalizzata dalla fumarasi (fumarato deidrogenasi). Questo enzima è altamente specifico e catalizza l’idratazione del doppio legame doppio legame trans del fumarato ma non reagisce sul maleonato, cioè l’isomero cis del fumarato.

Tappa 8: ossidazione del malato ad ossalacetato. nell’ultima reazione del ciclo dell’acido citrico, L-malato deidrogenasi NAD-dipendente catalizza l’ossidazione dell’L-malato ad ossalacetato.

L’energia delle ossidazioni che avvengono nel ciclo viene efficacemente conservata: nel ciclo è entrato un gruppo acetilico con due atomi di carbonio, combinandosi con l’ossalacetato. I due atomi di carbonio poi sono usciti sotto forma di due molecole di CO2 tramite l’ossidazione dell’isocitrato e poi dell’α-chetoglutarato. L’energia rilasciata da queste reazioni è stat conservata mediante la riduzione di NAD e FAD e la produzione di una molecola di ATP o GTP. Alla fine del ciclo è stata riciclata una molecola di ossalacetato. Si noti che i due atomi di carbonio che sono stati eliminati nel ciclo sotto forma di CO2 non sono gli stessi entrati sottoforma del gruppo acetilico, sono necessari altri giri del ciclo per farli uscire. Il ciclo dell’acido citrico di per se produce una sola molecola di ATP per giro, ma nelle quattro reazioni di ossidazione che avvengono nel ciclo vengono liberti molti elettroni e donati a NADH e FADH2, che li traferiscono alla catena respiratoria e determinano la produzione di un gran numero di molecole di ATP nella fosforilazione ossidativa. Dal trasporto di elettroni da parte del NADH all’ossigeno si formano 2,5 molecole di ATP; mentre il trasferimento di due elettroni dal FADH2 all’ossigeno ne forma circa 1,5. Quando due molecole di piruvato sono ossidate completamente a 6 molecole di CO2 della reazione del complesso della piruvato deidrogenasi e del ciclo dell’acido citrico e gli elettroni sono traferiti alla catena respiratoria, in totale si ottengono 32 molecole di ATP per molecola di glucosio. la funzione del ciclo dell’acido citrico non è però esclusivamente quella di ossidare aceteto ma vengono prodotti anche tanti intermedi a 4-5 atomi di carbonio che possono servire come sostanze per produrre altre molecole. I componenti del ciclo dell’acido citrico sono importanti intermedi biosintetici: negli organismi aerobici il ciclo dell’acido citrico è una via anfibolica , cioè serve sia ai processi anabolici che ai processi catabolici. Non soltanto agisce nel catabolismo ossidativo di dei carboidrati degli acidi grassi e degli amminoacidi ma produce precursori per molte vie biosintetiche, ad esempio l’α-chetoglutarato e

l’ossalacetato vengono sottratti al ciclo per essere utilizzati come precursori degli amminoacidi aspartato e glutammato. Le vie anaplerotiche riforniscono di intermedi il ciclo dell’acido citrico: quando al ciclo dell’a. citrico vengono sottratti intermedi essi possono essere rimpiazzati mediante reazioni anaplerotiche. In condizioni normali esiste un equilibro dinamico tra reazioni che rimuovono intermedi dal ciclo e quelle che lo riforniscono. Quindi la concentrazione di questi intermedi resta costante. La più importante reazione anaplerotica che avvengono nel fegato e nel rene è la carbossilazione reversibile del piruvato a CO2 per formare ossalacetato, reazione catalizzata dalla piruvato carbossilasi. Quando il ciclo dell’acido citrico è povero di ossalacetato o qualsiasi altro intermedio, il piruvato viene carbossilato ad ossalacetato e richiede energia che viene fornita da ATP. La piruvato carbossilasi è un enzima regolatore ed è praticamente inattiva in assenza di acetil-coA, il suo modulatore allosterico positivo. Ogni qualvolta che l’acetil co-A è presente in eccesso, esso stimola la reazione della piruvato carbossilasi a produrre più ossalacetato, consentendo quindi al ciclo di utilizzare più unità di acetil-coA nella reazione della citrato sintasi. La biotina nella piruvato carbossilato trasporta gruppi CO2: la reazione della piruvato carbossilasi richiede la vitamina biotina come gruppo prostetico dell’enzima. Essa è un trasportatore specializzato di gruppi ad un atomo di carbonio sotto forma di CO2. I gruppi carbossilici sono attivati in una reazione che idrolizza ATP e lega CO2 alla biotina legata all’enzima. La CO2 attivata viene quindi donata ad un accettore in una reazione di decarbossilazione. La piruvato carbossilasi è costituita da 4 subunità identiche contenenti ciascuna una molecola di biotina legata covalentemente mediante un legame ammidico alla lisina del sito attivo dell’enzima. La carbossilazione del piruvato procede in due fasi: prima il gruppo carbossilico dell’ HCO-3 viene legato alla biotina e poi viene trasferito al piruvato per formare ossalacetato.

Queste due tappe avvengono sui siti attivi separati, il braccio lungo e flessibile della biotina consente il trasferimento del gruppo carbossilico attivato dal primo sito attivo al secondo. La biotina è una vitamina che deve essere presente nell’uomo, si trova in molti cibi e viene anche sintetizzata dai batteri intestinali. Malattia da carenza di biotina sono in genere rare e si osservano soltanto quando vengono ingerite grandi quantità di uova crude che contengono grandi quantità di avidina che si lega molto saldamente alla biotina e impedisce il suo riassorbimento nell’intestino.

Regolazione del ciclo dell’acido citrico: il complesso della piruvato deidrogenasi nei mammiferi è fortemente inibito dall’ATP, dall’acetilco-A e dal NADH, i prodotti della reazione da esso catalizzata. AMP co-A e NAD+ la loro concentrazione tende ad aumentare quando il flusso di unità acetiliche all’interno del ciclo è bassa; inattivano allostericamente il complesso della piruvato deidrogenasi. nel complesso della piruvato deidrogenasi nei mammiferi, a questi meccanismi di regolazione allosterica si aggiunge un secondo tipo di regolazione mediante modificazione covalente. Il complesso enzimatico viene inibito dalla fosforilazione reversibile di uno specifico residuo di Ser su una della sua subunità E1. Una specifica proteina chinasi fosforila e inattiva l’enzima E1 e questa a sua volta è attivata allostericamante tramite ATP. Il ciclo dell’acido citrico è regolato a livello delle sue tre tappe esoergoniche: la velocità del flusso attraverso il ciclo è regolata da tre fattori: la disponibilità di substrato, l’inibizione da accumulo di prodotti e l’inibizione allosterica retroattiva dei primi enzimi del ciclo da parte degli ultimi intermedi. Vi sono tre tappe fortemente esoergoniche nel ciclo: quelle catalizzate dalla citrato sintasi, dall’isocitrato deidrogenasi e dall’α-chetoglutarato deidrogenasi. La disponibilità dei substrati per la citrato sintasi che sono acetil-coA e ossalacetato, vale a seconda dello stato metabolico della cellula, ed in alcuni casi può limitare la velocità del processo. Il NADH è il prodotto dell’ossidazione dell’isocitrato e dell’α-chetoglutarato, può accumularsi e, quando il rapporto NADH/NAD + , quindi la concentrazione di NAD diminuisce, entrambe le reazioni deidrogenasiche sono fortemente inibite; quando il rapporto è elevato la concentrazioni di ossalacetato è bassa e limita la velocità del processo. Un accumulo dei prodotti inibisce tutte e tre le tappe limitanti del ciclo. Il succinil co-A inibisce l’α-chetoglutarato deidrogenasi...