Chapitre 3 - Protéines acides aminés PDF

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L1 biologie et ingénierie : 1er semestre : Cours biomoléculaire

Les protéines (Acides aminés) I) Introduction A) Caractères généraux Une protéine , c'est quoi ? Les protéines sont des macromolécules constituées d'acides aminés, qui, à leur tour, sont composés de carbone, d'hydrogène, d'oxygène, d'azote et parfois de soufre. Ces acides aminés sont liés par des liaisons peptidiques sous forme de longs fila$ ments (chaînes polypeptidiques). Ceux-ci s'enroulent en un nombre quasi infini de formes hélicoïdales ou sphériques, ce qui explique l'immense variété des fonctions assurées par les protéines. Elles sont présentes chez tous les organismes vivants et sont essentielles à leur fonctionnement. On estime qu'il existe environ trente mille protéines différentes chez l'homme, dont 2% seulement ont été décrites. Ce sont les principaux effecteurs de tout se qui passe dans une cellule . La forme des protéines est très variable : elle va des longues fibres présentes dans les tissus conjonctifs et les cheveux aux globules compacts et solubles capables de traverser la membrane des cellules. Elles servent à construire et à entretenir les cellules, et leur dégradation chimique fournit de l'énergie, produisant près de 5,7 ki$ localories par gramme. L'ordre de la séquence des acides aminés distingue une protéine d'une autre. La sé$ quence en acides aminés détermine la forme tridimensionnelle de la protéine. Une modification de la séquence en acides aminés dans une protéine change sa structure tridimensionnelle. La différence entre un polypeptide et une protéine est que le terme polypeptide ré$ fère uniquement à l'enchaînement d'acide aminés alors que le terme protéine s'ap$ plique à une chaîne d'acides aminés après son repliement correct et dans certain cas sa modification. Les protéines peuvent être constituées de plusieurs chaînes poly$ peptidiques. Qu'elles sont les fonctions des protéines ? • Catalyse de réactions • Structure • Liaison • Régulation Oligopeptides : – Dipeptides : 2 acides aminés – Tripeptides : 3 acides aminés – Decapeptides : 10 acides aminés 1

– Généralement non codés par un gène – Synthèse enzymatique Polypeptides ou protéines: – Holoprotéines – Hétéroprotéines

II) Les acides aminés Qu'est ce qu'un acide aminé ? A) Introduction Les acides aminés représentent l'alphabet des structures protéiques. Ils déterminent la plupart des propriétés importantes des protéines. Les acides aminés (ou aminoacides) sont des composés organiques contenant le groupe amino (–NH2) et le groupe carboxyle (–COOH), et sont les constituants fondamentaux des protéines. On connaît 150 acides aminés qui ont été isolés à partir des différentes cellules et organismes ; toutefois, seuls 20 acides aminés rentrent dans la constitution des pro$ téines. Ce sont les alpha-aminoacides, molécules chargées ou électriquement neutres : l'alanine, l'arginine, l'asparagine, l'acide aspartique, la cystéine, l'acide glutamique, la glutamine, la glycine, l'histidine, l'isoleucine, la leucine, la lysine, la méthionine, la phénylalanine, la proline, la sérine, la thréonine, le tryptophane, la tyrosine et la valine. B) Formule générale Ces acides aminés ont la formule semi-développée générale suivante :

Comme le montre la figure 1 , les groupes amino et carboxyle sont liés au même atome, l'atome de carbone alpha. C'est par la chaîne latérale R que les molécules des vingt acides aminés diffèrent les unes des autres. Dans les molécules du plus simple des acides aminés : la glycine, R est un atome d'hydrogène.

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Numérotation des atomes de carbone :

L'atome de carbone directement lié au groupe car$ boxyle est le carbone alpha , et si le groupe amino est aussi sur ce carbone , il s'agit d'un acide carboxylique aminé en position alpha , autrement dit un acide al$ pha-aminé .

Exemple : La glycine

Amino Carboxyle

Carbone α

R devient H

L'acide aspartique

Les autres acides aminés ont des groupes R plus complexes, constitués d'atomes de carbone, d'hydrogène et, dans certains cas, d'oxygène, d'azote ou de soufre.

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Selon la nature de la chaîne latérale R , on distingue :

les acides aminés polaires les acides aminés apolaires les acides aminés hydrophobes C) Configuration des acides aminés Les acides aminés naturels ont la configuration qui correspond au L-glycéraldéhyde :

Miroir Plan

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Les deux molécules sont l'image l'une de l'autre dans un miroir . Si on tourne la première on voit qu'elle ne sont pas superposables . Tous les acides aminés sont chiraux ( sauf glycine ) . La forme L est prédominante dans la nature . Basées sur la nomenclature du D et L glycéraldéhyde . La nomenclature R et S est plus informative surtout que l'isoleucine et la théronine ont 2 atomes chiraux et peuvent donc être nommés de manière ambiguë avec le système D et L .

Un carbone chirale confère des propriétés optiques importante = pouvoir rotatoire = optiquement active .

D) Les acides aminés essentiels Parmi les 20 acides aminés : on a deux types :

• 11 sont synthétisés par l'organisme : acides aminés non essentiels • 9 sont issus de l'alimentation : les 8 acides aminés essentiels La plupart des plantes et des micro-organismes peuvent synthétiser, à partir de composés minéraux, tous les acides aminés qui sont nécessaires à leur croissance. 5

Les animaux, eux, ne peuvent obtenir certains acides aminés que par leur nourriture ; ces acides aminés particuliers sont dits essentiels. Chez l'homme, les acides aminés essentiels sont en nombre de neuf : la lysine, le tryptophane, la valine, l'histidine, la leucine, l'isoleucine, la phénylalanine, la thréonine et la méthionine. L’histidine est un acide aminé essentiel uniquement pour les enfants. A côté de ces neufs acides aminés, s'ajoutent les acides aminés considérés comme conditionnellement indispensables (indispensables dans certains conditions). Par exemple, la glutamine et l’arginine peuvent devenir indispensables pendant les périodes de stress métabolique. Les acides aminés essentiels proviennent de l'alimentation. On les trouve dans les aliments d'origine animale, riches en protéines, ou dans des associations de protéines végétales. E) Les acides aminés non essentiels Ils sont fabriqués par l'organisme a partir des précédents : alanine, arginine, asparagine, acide aspartique, cystéine, glutamine, acide gluta$ mique, glycine, histidine, tyrosine. Tableau présentant les 20 acides aminés avec le code des 3 lettres

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F) Les propriétés des 20 principaux acides aminés

G) Propriétés acide-base En raison de la présence simultanée des deux fonctions acide et base , les acides aminés ont un comportement amphotère : l'état de la molécule va dépendre du pH .

On distingue trois catégories :

• Les aminoacides acides : Asparagine et acide glutamique (glutamate). • Les aminoacides basiques : Lysine, arginine, et histidine. • Les aminoacides neutres : les autres aminoacides. Ainsi , l'état d'ionisation d'un aminoacide dépend du pH du milieu .

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Fonction acide

Fonction amine

Dans l'eau , quelque soit le pH , les acides aminés sont des espèces chargées . On peut régler le pH pour atteindre le point isoélectrique mais en aucun cas , les es$ pèces ne sont exemptes de charges .

Forme Basique

Forme Acide

Ph= 7 Ph = point Isoélectronique

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Courbe de titration d'un acide aminé :

H) Propriétés spectroscopique Tous les acides aminés absorbent en infra-rouge . Seulement Phe , Tyr et Trp absorbent dans l'UV .

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II) Les peptides A. Qu'est-ce que la liaison peptidique ? Les acides aminés peuvent se lier les uns aux autres par un seul type de liaison : la liaison peptidique . La liaison peptidique est formée durant l'étape de traduction par une liaison covalente entre deux groupements -COOH d'un acide aminé et le groupement aminé -NH2 de l'autre . Au cours de la réaction , une molécule d'eau est éliminée .

La liaison peptidique 6 remarques : Au sien de la liaison peptidique = le groupement NH2 et COOH sont bloqués . Qu'est ce qu'un peptide ? Un peptide est une molécule constituée d'acides aminés enchaînes par un lien peptidique (amide ) .

Par convention , on écrit et numérote un peptide de son extrémité N-terminale a son extrémité C-terminale .

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Engagé dans un peptide , un acide aminé est appelé résidu . Il s'écrit par le nom de l'acide aminé +..yl(seryl , tyrosyl ..) . Un peptide comporte 2 à 100 acide aminés. Un peptide comporte : -une partie peptide appelée chaîne principale constitué de l'enchaînement des liaisons peptidiques . -Une partie variable comportant des chaînes latérales . Une protéine est un polypeptide particulier de poids moléculaire élevé et constitué à partir des 20 acides aminés . L’enchaînement des résidus constitue la structure primaire : quels sont les acides aminés ? Combien ? Quelle est la séquence ? B. Structure de la liaison peptidique Structure spatiale

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Donc cette liaison peptidique C-N possède le caractère d'une double liaison partielle . Ce caractère est suffisant pour bloquer la libre rotation = facteur de rigidité . Soit les 2 carbones α se trouvent de part et d'autre du plan de liaison = structure Trans . Les chaînes latérales sont le plus loin possible l'une de l'autre . Soit les 2 carbones α se trouvent du même cote du plan = structure Cis . Les chaînes latérales sont plus porches .

Donc conformation trans des liaisons peptidiques . La liaison Cis n'est pas favorable car on a un encombrement stérique et une répulsion électrostatiques des chaînes latérales . C. Propriétés Optique Absorption de la liaison peptidique = 190 nm Mais mesure à 214nm car trop de solutions tampons absorbent à 190 nm Conservation des propriétés d’absorption des acides aminés aromatiques . Acido-Basique Étant donné que les COOH et les NH2 sont engagés dans la liaison peptidiques et sont bloqués , ces groupements perdent leurs propriétés acido-basique . Conservation des propriétés acido-basique des chaînes latérales . Même si elles peuvent être modifiées en fonction de l’environnement spatiale . 12

D. Structure primaire des protéines A la fin de la biosynthèse, les chaînes polypeptidiques subissent un reploiement en structures complexes qui créent des cavités dans lesquelles viendront se loger de petites molécules, par exemple des antigènes, s’il s’agit d’anticorps, des substrats, s’il s’agit d’enzymes. Cette structure dépend d’abord de la séquence et de la composition (nombre et na$ ture des acides aminés) de la protéine, c.à d. de sa structure primaire. Cette struc$ ture est obtenue par le séquençage de la protéine.

• Liaisons hydrogènes

Dans une même chaîne ou entre deux chaînes différentes , les liens hydrogènes créent rigidité et organisation de la protéine . -Liaison non covalente -S'établit entre un atome d'Hydrogène lié covalemment avec un O ou N et un doublet électronique d'un oxygène ou d'un azote . -Liaison faible -Entre des résidus : - hydroxyle de la sérine / Thréonine / tyrosine - Noyau imidazole de l'histidine... -Peut-être intra-chaine = maintien la conformation hélicoïdale -Peut-être interchaines

• Forces de Van der waals 13

- Liaison non covalente - Liaison faible - S'établit entre un dipole permanent qui attire un autre dipôle permanent

• Forces hydrophobes - Liaison non covalente - S'établit entre les résidus Apolaires = chaîne latérale hydrophobe ( Ala , Val , Leu , Ile , Phe..)= Ces résidus ne forme pas de liaison hydrogène avec l'eau . Les chaînes latérales auront tendances a se rapprocher . - De force moyenne

• Liaisons ioniques / électrovalence - Liaison non covalente - S'établit entre un radical chargé + (-NH2) et un radical chargé - (-COO-) . - Implique les résidus polaires -Plus forte que la liaison hydrogène

• Les ponts disulfures

- Liaison covalente = donc forte - Être 2 cystéines de la chaîne polypeptidique , un lien disulfure peut former une boucle . Deux chaînes peuvent aussi s'accrocher par ce lien . - Absent de la plupart des protéines intracellulaires car dans la cellule , l'environnement est hautement réducteur . - Sont courant dans les protéines sécrétées . E. Structure secondaire des protéines 14

Dans la forme reploiée, on trouve des structures régulières facilement reconnaissables : des hélices et des feuillets. On appelle celles-ci des structures secondaires.

• Les hélices alpha - Dans la chaîne polypeptidique , liaisons hydrogène entre C=O et NH2 .

-Les hélices alpha sont caractérisées par : un pas de 5,4 A et 3,6 acides aminés par tour d 'hélice en moyenne . Des liens hydrogène contribuent à cette structuration en hélice . - Enroulement en bâtonnet de la chaîne principale = chaînes latérales a l'extérieur . - Stabilisation par des liaisons hydrogènes de 2,8 +/- 0,2A entre C=O et NH de la chaîne séparés par 3 résidus . - Hélices droites : sens des aiguilles d'une montre . - Hélices favorisées par Ala , Glu et Leu . - Hélices défavorisés par Pro , Gly , Tyr et Ser .

• Les feuillets β - antiparallèle

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parallèle

Certaines protéines contiennent des éléments de structure en feuillets plissés, à nouveau ordonnés entre autre grâce à des liens hydrogène. F. Structure tertiaires des protéines Les protéines se présentent sous plusieurs aspects en raison de leur forme qui est ré$ glée par les interactions de type liens H ou S-S et par la solubilité et la polarité de leurs différentes zones. La répartition dans l’espace de tous les atomes d’une chaîne polypeptidique consti$ tue sa structure tertiaire. Les motifs de structure , il en existe 4 modèles : Tout α , β , α/β et α+β avec des zones ordonnées reliées par des zones flexibles ( coudes , boucles , random ) . Groupe H : Voir TD exos

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G. Structure quaternaire des protéines Ceci relève de l'agglomération de sous unités entre elles : l'hémoglobine est un agré$ gat de 4 polypeptides sphériques. H. Pourquoi devons nous purifier les protéines ? A quoi sert la purification : -permet d'étudier les propriétés d'une protéine . -Détermine les séquences en acide aminé . -Détermine la structure tridimensionnelle . Le problème : Les cellules contiennent généralement plus de 1000 types de protéines différentes . Chaque protéine a donc en moyen,ne une abondance inférieur à 1/1000. Comment faire : Se servir des différences de propriétés physico-chimiques et biochimiques des pro$ téines : -solubilité , taille , point isoélectrique charge , hydrophobicité et affinité pour cer$ tains ligands . A quelle température travailler ? Les protéines sont facilement dénaturées à haute température et se dénature lente$ ment à 25°C . 17

La purification des protéines se fait normalement à 4°C . Quelles précautions prendre ? Les cellules contiennent des protéases qu'on peut inactiver ou inhiber par des agents chimiques spécifiques . Autres précautions : Éviter l’oxydation des résidus cystéines , éviter la contamina$ tion par des métaux lourds.. Séparation de protéines par Électrophorèse SDS-PAGE Principe SDS – PAGE = sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis. => Électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS L’électrophorèse SDS-PAGE, repose comme toute technique électrophorétique, sur la séparation de molécules chargées dans un champ électrique. Une cuve à électro$ phorèse est reliée à deux bornes (une cathode (-) et une anode (+)) alimentées par un générateur électrique : les molécules que l’on intercale dans ce champ migreront, selon leur charge, vers le pôle complémentaire. La particularité de la SDS-PAGE est de soumettre les échantillons protéiques à un prétraitement dénaturant. Les protéines sont soumises à l’action de deux composés : -le β mercaptoéthanol : composé qui exerce une action dénaturante sur les protéines oligomériques en rompant les ponts disulfures ce qui désorganise leur structure tridimensionnelle. Les sous unités des protéines sont donc dissociées. -le SDS (sodium dodécyl sulfate) : c’est un composé capable de venir se fixer sur la périphérie des chaînes de protéines tout en leur conférant une charge néga$ tive. Dans électrophorèse SDS-PAGE*, la vitesse de migration dépend : - taille sous unités (protéines dénaturé) - degrés réticulation du gel *Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. Intérêt de la manipulation Grâce à la SDS-PAGE, il est possible de déterminer assez finement la présence d’une protéine donnée dans un échantillon protéique. Une protéine sera caractérisée par une masse moléculaire donnée.

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Protocole On mélange les protéines avec le SDS (et le mercaptoethanol). On chauffe 5 mn a 90°C les protéines dénaturés. Les protéines fixent de grandes quantités de détergent (1,4g de SDS par gramme de protéines). Cela masque complètement la charge naturelle de a protéine et lui donne une charge négative constante par unité de masse. La mobilité electrophoretique dépend alors principalement de la taille. Dans le gel de concentration Dans le gel de concentration (pH 6,5, acrylamide 4%), les espèces sont :

- les ions chlorure (très mobile) - les protéines (mobile, chargées par le SDS) - La glycine faiblement chargé (peut mobile) Les ions chlorure avance très rapidement. Derrière eux, on trouve une zone sans transporteur de charges , s'il y a peu de charges, il y a augmentation du potentiel électrique U=RI. Ce fort courant électrique force la migration de la glycine et des protéines qui vont stocker au font de migration des ions chlorure. On obtient ainsi de très fines bandes de protéines.

Lorsqu'on arrive dans le gel de migration (Ph 8,8 polyacrylamide 6-15%) les espèces négatives qui vont migrer sont : - les ions chlorure - les protéines sont ralenties (% acry plus imp) - la glycine est chargé (très mobile) Les protéines plus grosses sont maintenant les espèces les plus lentes. La glycine passe devant les protéines.

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