CM1 Chromatographie - Notes de cours 1 PDF

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Licence 2 Chimie Sciences de la Vie parcours chimie biologie ; CM1 Chromatographie ; Professeur : M. Carbonnier...

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Chromatographie CM1 – 18/01/2021 Chapitre I : Chromatographie, généralités et définitions importantes La chromatographie est un procédé physico-chimique de séparation des constituants d’un mélange liquide ou gazeux homogène. Elle permet l’identification (quels sont les espèces qui sont présents) et la quantification des composés présents. Principe : repose sur les équilibres de concentration des composées entre deux phases non miscibles dont l’une, dite stationnaire (PS), est emprisonnée dans une colonne ou fixée sur un support et l’autre, dite mobile (PM), se déplace au contact de la première. L’entrainement à des vitesses différentes des composés présents dans la phase mobile conduit à leur séparation. Mélanges hétérogènes ou solides : transformés en mélange liquide homogène par utilisation d’un solvant (dissous tout dans un solvant) Deux types de méthodes chromatographiques Chromatographie sur colonne : Phase stationnaire est maintenue dans un tube étroit et la phase mobile progresse par gravité ou sous l’action d’une différence de pression. Chromatographie planaire : Phase stationnaire est présente à la surface d’un support plat (chromatographie sur couche mince - CCM) pu immobilisée à l’intérieur des pores d’une feuille de cellulose (chromatographie sur papier). La phase mobile se déplace à travers la phase stationnaire par capillarité ou sous l’effet de la gravité. Les méthodes chromatographiques se classent en trois catégories Selon la nature de la phase mobile : liquide, gaz ou fluide supercritique.

PM

PS b

Lors de la chromatographie en phase liquide, dans le mode liquide-phase greffé, la phase mobile est la phase liquide et la phase greffée (peut être considéré comme un liquide) est la phase stationnaire. Les méthodes liquide-liquide ou liquide-phase greffée ont un type d’équilibre qui est le partage. La méthode liquide-solide, c’est de l’adsorption. L’échange d’ions permet de séparer les ions. La chromatographie en phase liquide, celle liquide-gel permet la séparation des molécules en fonction de la taille. Pour la chromatographie en phase gazeuse, celle gaz-liquide et gaz-phase greffée ont un type d’équilibre qui est pratiquement le même que la chromatographie en phase liquide. C’est-à- dire que le type d’équilibre est un partage du gaz avec la phase stationnaire. De même, lorsque la phase stationnaire est un solide, le type d’équilibre est de l’adsorption. La chromatographie supercritique utilise du CO2, lorsque l’on est en température ambiante, on obtient un gaz. On va donc utiliser le CO2 en condition supercritique pour qu’il soit en phase liquide, de plus il est un bon solvant. Mise en œuvre : cas de la chromatographie liquide sur colonne 1- Immobilisation dans une colonne d’un solide finement divisé (PS) 2- On place au sommet de cette colonne (C) un petit volume d’échantillon (E) à séparer 3- On force l’échantillon au moyen de la phase mobile (PM) à traverser la colonne afin d’entraîner ses divers constituants (E1,2,3 ). Si les composés migrent à des vitesses différentes, ils pourront être recueillis séparément.

Ici, on a des échantillons qui se déplacent à différentes vitesses, puis on observe un détecteur, ce dernier va enregistrer l’intensité du signal en fonction du temps. Quand la phase mobile passe devant le détecteur, il n’y a pas de signal, sur le graphe, on obtient une ligne de base qui est à 0 en intensité. Quand un espèce arrive devant le détecteur, on va donc obtenir un signal associé à l’espèce.

Dès qu’une espèce passe devant le détecteur, on obtient un signal qui dépend de la concentration de l’espèce. Quand l’espèce est au milieu du détecteur, nous sommes au sommet du pic. Et ainsi de suite pour les autres espèces.

Ici, pour le chromatographe, nous avons une phase mobile, qui est l’éluant et pour faire circuler la phase mobile dans la phase stationnaire, on utilise une pompe. La phase mobile est donc aspirée par la pompe, on va donc passer par une boucle d’injection. La colonne va contenir la phase stationnaire et elle est connectée au détecteur, puis enfin, on a une interface informatique pour le traitement des données. Chromatographe

Notions abordées et à connaitre Phase stationnaire : phase qui reste en place soit dans une colonne, soit sur une surface plane. Phase mobile : phase qui se déplace sur ou au travers de la phase stationnaire, en entrainant l’analyte avec elle. Chromatographie : technique dans laquelle les constituants d’un mélange se séparent en fonction des vitesses auxquelles ils sont au travers une phase stationnaire par une phase mobile gazeuse ou liquide. Éluant (PM): solvant utilisé pour entrainer les constituants d ’un mélange au travers une phase stationnaire. Élution : processus au cours duquel les solutés sont entrainés à travers une phase stationnaire par le mouvement d’une phase mobile. Chromatogramme : graphique d’une fonction de la concentration en soluté en fonction du temps d’élution ou du volume d’élution.

Chapitre II : Grandeurs fondamentales en chromatographie sur colonne

Progression du soluté dans la colonne ? En vert = PS et en bleu = PM, on rajoute ensuite des solutés en rouge. Vitesse de déplacement d’un soluté au travers d’un PS entrainé par une PM (cherche à connaitre). La colonne est le rectangle, qui est coupé transversalement, la colonne est remplie d’une phase stationnaire, qui sont les billes. D’une phase mobile, qui est en bleu. À t=0, l’échantillon est injecté dans la colonne. À t=1, le soluté] a parcouru un chemin grâce à la phase mobile, et est entrainé] au contact de la phase mobile par la phase stationnaire. À t=2, c’est le temps de fin d’analyse, le soluté] est en sortie de colonne. Il arrive donc vers le détecteur, ce dernier est connecté à la sortie de la colonne. En réalité], toute la section de la colonne est remplie par l’échantillon, c’est-à_-dire qu’à un instant t=1, toute la colonne est remplie du même échantillon. Quand on arrive à t=2, en fin d’analyse, c’est une section entière de la colonne, qui va sortir de la colonne. Donc, dans les mêmes conditions, les solutés identiques ont une progression identique. Pouvoir séparateur d’une colonne dépend des vitesses relatives d’élution des constituants définies par les coefficients de distribution des solutés entre les deux phases. Il y a 2 bandes d’échantillons dans la même colonne, elles vont se déplacer de manière différente. Dans les mêmes conditions d’analyses, les solutés différents ont une progression différente. Échantillon vert et rouge ne se déplace pas à la même vitesse.

1 – Coefficient de distribution K Les séparations en chromatographie sont basées sur les différences de répartition des solutés entre la phase mobile et la phase stationnaire. Pour un soluté A, il y a un équilibre de distribution :

Rapport de concentration de chaque soluté entre les deux phases en présence dans la colonne.

La relation de la thermodynamique s’applique aussi : ∆𝐺"="−𝑅𝑇"∗"ln"(𝐾)"

2 – Temps de rétention Le temps de rétention est un paramètre très important pour l’identification des pics et donc des constituants d’un mélange. Le résultat d’une analyse est un chromatogramme. Si on s’intéresse à une espèce non retenue, c’est une espèce qui n’a aucune interaction avec la phase stationnaire, c’est une molécule de la phase mobile. Le temps mort, aussi dit tm, est l’intervalle de temps qui s’écoule entre l’introduction de l’espèce non retenue dans la colonne et le pic correspondant à cette espèce. Le temps mort est la mesure inverse de la vitesse moyenne de déplacement des molécules de la phase mobile. Si nécessaire, on rajoute un composé non retenu. Temps de rétention (tR) : intervalle de temps qui s’écoule entre l’introduction d’une espèce retenue dans la colonne et le pic correspondant à cette espèce.

3 – Volume de rétention ou d’élution (VR ) C’est le volume de phase mobile nécessaire pour faire migrer une espèce d’une extrémité à l’autre de la colonne. Le volume de rétention ne correspond pas au volume du pic. Sur le chromatogramme, il correspond au volume de la phase mobile qui s’est écoulé entre l’introduction et le temps qui correspond au sommet du pic. Si le débit est constant D (mL/min). VR=tR x pic.

D VR ne correspond pas au volume du

4 – Volume de la phase mobile dans la colonne ou volume mort (Vm) Le volume mort correspond à la somme des parties interstitielles accessible entre les billes. Peut être calculé à partir du volume d’élution d’une espèce non retenue par la phase stationnaire. VM=tM x D.

5 – Vitesse linéaire moyenne de déplacement Espèce retenue

Espèce non retenue

6 – Volume de la phase stationnaire (VS) Différence entre le volume totale de la colonne vide et le volume de la phase mobile. En sachant que le volume d’une colonne est la section multipliée par la longueur.

7 – Facteur de rétention (k’) La masse totale (mT) d’un composé introduit dans une colonne se répartit en deux quantités : mM dans la phase mobile et mS dans la phase stationnaire. Au cours de la migration du composé dans la colonne, ces quantités restent constantes. k’ indépendant du débit ou de la longueur de la colonne varie avec les conditions opératoires n’est donc pas constant en chromatographie. k’ paramètre le plus important pour caractériser une colonne. k’ caractérise la capacité d’une colonne à retenir un composé. Détermination de k’ *m=n x M (M pareil donc pas pris en compte) TS on ne connait pas mais à partir de différents tR donnés, on peut déduire t’R soit tS ....