¿Cómo influye la papaína en la extracción de ADN en sustancias diluidas de dos tejidos vegetales? PDF

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Experimento en el que se identificar la influencia de la papaína en la extracción de ADN en sustancias diluidas de dos tejidos vegetales

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COLEGIO PERUANO NORTEAMERICANO ABRAHAM LINCOLN PROGRAMA DEL DIPLOMA

Biología Nivel Medio: Informe de Laboratorio #6

Extracción de ADN

Alumno: Sebastian Perez Profesor: Rosa Dávalos

11°C 2018

Extracción de ADN

1. Pregunta de investigación ¿Cómo influye la papaína en la extracción de ADN en sustancias diluidas de dos tejidos vegetales? 2. Objetivo  Identificar la influencia de la papaína en la extracción de ADN en sustancias diluidas de dos tejidos vegetales

3. Marco teórico 

Lisis celular y nuclear Las

células

animales

están

unidas

por

una

membrana

celular

semipermeable. En el interior de ésta, los orgánulos están suspendidos en un líquido llamado citosol, o citoplasma. Éste contiene azúcares, sales, proteínas solubles y las proteínas estructurales del citoesqueleto (una estructura que mantiene la forma celular). La membrana celular puede romperse o hacerle una lisis, mecánicamente, químicamente o por alguna combinación de los dos. Para realizar la lisis química, las células se suspenden en una solución que contiene detergentes y otros reactivos que interfieren con los enlaces químicos que sostienen las proteínas de las membranas juntas. Esto resulta en la rotura de la membrana y la liberación de los componentes intracelulares. 

La papaína La papaína que se extrae de la papaya es una enzima proteolítica, es decir, con capacidad para digerir las proteínas de los alimentos. Similar a la pepsina, una enzima que está en nuestro jugo gástrico, sus aplicaciones son en distintas áreas. Además, esta hidroliza tanto las proteínas como los péptidos de pequeño tamaño, amidas y ésteres. Este tiene la misma función que la del ablandador de carnes



Efecto del alcohol isopropílico La acción del alcohol es limpiar el ADN de otras biomoléculas a través de la precipitación. En este proceso el alcohol hace que el ADN pierda contacto con las moléculas de agua que lo rodean y lo aísla de la solución acuosa. El ADN es soluble en agua, pero cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua. Este proceso se realiza en el Test de pectina.



Uso del detergente Es una manera más suave de romper la membrana celular. Los detergentes rompen la barrera lipídica solubilizando las proteínas e interrumpiendo la interacción lípido-lípido, lípido-proteína y proteína-proteína. Los detergentes, al igual que los lípidos, se asocian entre ellos y se unen a superficies hidrofóbicas. Al romperse las membranas celulares se permite la salida del ADN al exterior al igual que proteínas, conocidas como las nucleasas. En otras palabras, el detergente sirve para lisar a las células, romperlas para liberar su contenido. Estos tienen una zona hidrofílica y otra hidrofóbica, por esta razón pueden interactuar tanto con el agua como con los lípidos A alta concentración se produce una degradación que

resulta

lineal

a

la

concentración

de

detergente, junto a esta variable también se altera la tensión superficial de la solución. 

Nucleasas Estas se liberan al lisar a las células tienen como función degradar al ADN de patógenos como son las bacterias y los virus.



Uso de la sal La sal en disolución actúa disminuyendo la solubilidad de las proteínas, lo que hace que precipiten y se separen más fácilmente del ADN. La acción de la sal es cubrir los terminales fosfatos negativos, permitiendo así que los extremos se unan y el ADN precipite en la solución de alcohol.



Ablandador de carnes Su función es evitar que se degrade el ADN por acción de las nucleasas, y

esto es debido a que contiene proteasas que son proteínas especializadas en la degradación de otras proteínas. Además, en este experimento se utilizará la papaína como ablandador de carnes. extremos se unan y el ADN precipite en la solución de alcohol. Esta cambia la concentración ocasionando que ocurra fricción.

4. Variables Independiente: Poder catalizador de la papaína, que es extraído del ablandador de carne con proteasas. Dependiente: Rapidez de extracción de ADN, que se procura medir con el tiempo de reacción. Controladas: 1. Temperatura del alcohol isopropílico este más fría que la temperatura ambiente que será controlado con un termómetro. 2. Tipo de muestra, se controló al utilizar dos tipos y dos repeticiones por cada tipo. 3. Cantidad de muestra será controlada al utilizar una cantidad equitativa en las dos repeticiones de cada tejido vegetal. 4. Cantidad de papaína como ablandador de carne es la misma para todas las muestras. 5. Resultados 5.1. Datos cualitativos 5.1.1. Antes del experimento 

En el caso de la muestra de maracuyá este después de haber sido colado y que luego se le haya introducido agua, sal y dos cucharadas soperas de detergente obtuvo un color amarillo que es turbio que tiene burbujas en la parte superior. Además de eso no presento ningún cambio de color. Al poner la muestra en dos tubos de ensayo y una probeta, dos que se iban a utilizar para la extracción de ADN y la otra para el test de pectina, ninguno presento un precipitado.



En el caso de la muestra de fresa esta después de haber sido colada y que posteriormente se le haya introducido agua, sal y dos cucharadas soperas de detergente obtuvo un color rojo no tan

opaco, tiene un tono transparente. Este es un rojo claro y al poner la muestra en dos tubos de ensayo y una probeta, dos que se iban a utilizar para la extracción de ADN y la otra para el test de pectina, ninguno presento un precipitado.

Imagen de la muestra de maracuyá antes de agregar el alcohol isopropílico

Imagen de la muestra de fresa antes de agregar el alcohol isopropílico

5.1.2. Después del experimento 1. Muestra de maracuyá: a. En el caso de la muestra con el ablandador de carne, en ese tiempo

transcurrido

se

formó

el

ADN

más

adjunto

separándose lo demás del precipitado que se forma. Además, al separarse se crea un “vacío” entre ambos lados. Y el precipitado sigue con el mismo tono de color en comparación de antes, mientras que la parte superior donde está el ADN tiene un tono más blanco b. En caso de la muestra sin el ablandador la distancia entre la parte superior con el ADN y el precipitado es menor. Además, el ADN no es tan adjunto, se ve más disperso. Sin embargo, sigue

teniendo

el

mismo

color

que

tuvo

inicialmente y la parte superior si cambio a un color blanco. c. En caso del test pectina se formaron dos partes separadas por el medio, es decir que la muestra se rompió y se dividió en 2 al momento de agitarse. La parte superior es del mismo color que la del precipitado, pero lo que está en medio tiene un tono más claro. 2. Muestra de fresa: a. En el caso de la muestra con el ablandador de carne, en ese tiempo

transcurrido

se

formó

el

ADN

más

adjunto

separándose lo demás del precipitado que se forma. Además, al separarse se crea un “vacío” entre ambos lados. Y el precipitado sigue con el mismo tono de color en comparación de antes, mientras que la parte superior donde está el ADN tiene un tono más blanco b. En caso de la muestra sin el ablandador la distancia entre la parte superior con el ADN y el precipitado es menor. Además, el ADN no es tan adjunto, se ve más disperso. Sin embargo, sigue

teniendo

el

mismo

color

que

tuvo

inicialmente y la parte superior si cambio a un color blanco.

c. En caso del test pectina se formaron dos partes separadas por el medio, es decir que la muestra se rompió y se dividió en 2 al momento de agitarse. La parte superior es del mismo color que la del precipitado, pero lo que está en medio tiene un tono más claro.

Datos cuantitativos 5.1.3. Datos brutos -100mL de tejido diluido -25mL de alcohol isopropílico -Una pisca de sal -Dos cucharadas de detergente 6. Conclusión A través de este reporte experimental se pudo identificar la influencia de la papaína, que actuó como ablandador de carnes, en sustancias diluidas de los dos tejidos vegetales los cuales fueron fresa y maracuyá. A partir de los datos analizados se puede concluir que la papaína tiene una gran influencia en cuanto a la separación del ADN, como se pudo ver en las fotos, este al actuar como catalizador por acción de las nucleasas, y esto es debido a que contiene proteasas que son proteínas especializadas en la degradación de otras proteínas. Sin embargo, no solo fue importante el uso de la papaína en el proceso de extracción de ADN también fue de suma importancia el uso de varios componentes. Primero, el uso de la sal tuvo la función de disminuir la solubilidad de las proteínas y que estas se vayan precipitando separándose del ADN. Al igual que el detergente, lo que hace el detergente es romper la membrana celular ya que al romper la barrera lipídica permiten la salida del ADN junto a más proteínas que lo degradan, pero el ablandador de carnes al tener las proteasas no permite que eso ocurra, siendo esta la principal razón de cómo influye la papaína en la extracción de ADN. Finalmente, la acción del alcohol es limpiar el ADN permitiendo que su visualización hace que el ADN pierda contacto con las moléculas de agua que lo rodean y lo aísla de la solución acuosa con el fin de precipitarse. Debido a los resultados, los cuales fueron datos cualitativos, se demuestra que en la velocidad de reacción de la muestra de ambos tejidos vegetales con ablandador de carne es mayor a comparación de la muestra sin ablandador de carne y esto es debido a su función frente a las proteínas. Esto permite que se separe bien el ADN que tiene un aspecto más

consistente para el lado superior mientras que lo demás que le pertenece a la célula se ubica en la parte de abajo.

7. Evaluación 7.1. Limitaciones y Recomendaciones

Limitaciones

Recomendaciones

Se utilizo una bolsa como embudo al Se recomienda utilizar papel filtro de momento de colar maracuyá para que laboratorio porque su uso facilita el solo se utilice el líquido y no las pepas.

proceso y es más limpio porque no derrama la sustancia por los costados.

La temperatura del alcohol no era la Se

recomienda

introducirla

en

una

indicada ya que no fue lo suficientemente congeladora el día anterior y medir la temperatura con un termómetro. fría como para poder funcionar. El alcohol cayo muy rápido cuando se Se recomienda que al trasvasar el alcohol necesitaba agregar en la parte de no sea rápidamente y que sea por partes extracción de ADN, y rompió las hebras. para evitar que se rompan las hebras. Al momento de separar equitativamente Se recomienda utilizar más probetas para al solo tener tubos de ensayo no se que las medidas sean exactas ya que con podía separar de manera exacta y luego un beaker y con un tubo de ensayo no se al agregar alcohol se estimó la cantidad puede medir. a agregar. La cantidad de sal y de detergente se Se recomienda ser más precisos y masar estimó utilizando una cucharita.

la sal y el detergente para que en todas las muestras estos tengan el mismo valor y que todas estén

en las mismas

circunstancias antes de

que

introduzca el alcohol isopropílico.

8. Bibliografía

se

les

Alan Damon, Randy McGonegal, Patricia Tosto, William Ward. (2014). Biology standard level. Great Britain: Pearson. T.Audesirk, G.Audesirk, Bruce Myers. (2013). Biologia, La vida en la tierra. Mexico: Pearson. José Luque. "Bilogía Molecular e Ingeniería Genética", Prepración de muestras, extracción y análisis de ácidos nucleicos, Ediciones Harcourt, año 2001, Pág. 164-139...