Cours sur l\'hémoglobine PDF

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HEMOGLOBINE Généralités : Ce sont des protéines globulaires, constitué d’assemblage d’hélice alpha. Leur rôle est de transporter et stocker l’O2. C’est l’apparition des organismes, il y a plusieurs milliard d’années, qui ont rejeté de l’O2 mais celui-ci est toxique donc ils ont développé des mécanismes pour s’y protéger.

I – Evolution et transport de l’oxygène Chez les procaryotes, l’O2 diffuse et accède à la mitochondrie directement. Chez les eucaryotes il y a des cellules à la surface de l’organisme (alvéoles pulmonaires) qui peuvent le capter directement mais les cellules qui se trouvent au centre de l’organisme ne peuvent pas. Il va falloir un système de transport (plasma) et d’apport (alvéoles pulmonaire). Dès les vers de terre, le transport de l’O2 se fait via des protéines spécialisées. On peut solubiliser l’O2 mais cela reste difficile. La solubilité de l’O2 dans le plasma est faible: 10-4 M. Grâce à l’hémoglobine le sang peut transporter jusqu’à 10-2 mole/L d’O2. Transport d’oxygène: 0,1 litre/min soit 0,05 mole/min. Mais augmenté lors d’un effort. C’est le globule rouge assure le transport de Hb, et comme ils ont perdu leur noyau, ils ne réalisent plus de transcription mais encore un peu de traduction.

II - Cellules de transport de l’oxygène Chaque globule rouge contient 280 millions de molécules d’hémoglobine. La concentration sanguine en hémoglobine est de l’ordre de 150 g/L, soit 750 g d’hémoglobine par organisme. Durée de vie du globule rouge: 120 jours = renouvellement très important faisait intervenir différentes protéines comme la transferrine. 1. Transport du fer Toute les cellules sont capables de capté du Fer. Le fer est capté par les entérocytes et amené à la moelle osseuse (productrice de GR). C’est la concentration en atome de fer qui conditionne la production d’Hb. La transferrine transporte 2 atomes de fer qui sont sous la forme de fer oxydé ferrique (Fe3+). La liaison entre la transferrine et le fer est une liaison de coordinance. Interaction entre des Cyt et des Tyr. On parle d’apotransferrine quand elle est seule, sans Fer et d’holotransferrine quand elle a fixé les atomes de fer. 2. Stockage cellulaire du fer Dans les cellules, le fer est stocké par une protéine spécialisé qui est la Ferritine. Elle est composée de 24 chaines peptidiques : o L (liver) dans le foie qui fait 19 kDa o H (heart) dans le cœur : 22 kDa o La structure est une forme de cage où chaque molécule peut fixer 4500 atomes de fer. La Ferritine a donc une grande capacité de stockage. Le Fer toujours stocké sous la forme fer ferrique.

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Cycle de l’O2 : le poumon a un pouvoir de captation de l’O2 atmosphérique.  L’Hb transporte 4 atomes de fer contenu dans l’hème. Elle fixe 4 molécules d’O2.  O2 est libéré dans les tissus.  Les tissus émettent du CO2 qui diffuse dans le plasma passivement.  Il est transformé en NHCOO- puis en bicarbonate et par transport par l’hème.  Il est libéré dans la respiration.  Les bicarbonates sont transformés en CO2 pour être expulsé au niveau des poumons.

III - Les gènes de l’Hb Ils appartiennent à la superfamille de protéines à laquelle appartient aussi la myoglobine (R finaux du O2 dans les Tissu, fonctionne sous forme monomérique). - 650 Millions d’années: divergence entre l’Hb des invertébrés et l’Hb des vertébrés. - 450 Millions d’années: gène codant pour les chaines α/ß. Les gènes des différentes chaînes sont sur les chromosomes 11 (ß) et 16 (α). On retrouve la neuroglobine (peut capté le O2), la cytoglobine qui appartiennent à la même famille. Par la suite il y a apparition des chaines alpha et béta. Tous les gènes sont sur le même chromosome chez les poissons et grenouilles. L’ordre des gènes est toujours le même. Les gènes sont ordonnés en fonction de leur expression lors de l’embryogenèse. 1. Expression des différentes formes de chaînes de l’hémoglobine Pour le locus α : les chaines ζ (zéta) disparaissent avant la naissance car les chaines α ont pris le relais. Pour le locus β : on a des chaines ε qui sont synthétisé en 1er, pendant phase embryonnaire. Le relais est pris par les chaines γ pendant la vie fœtale et vont disparaitre après la naissance. La drépanocytose est la persistance de l’expression des chaines γ après la naissance. Les chaine β connaissent un pic après la naissance et prennent le relais des γ. Les chaines δ sont toujours sécrétées de façon infime, même après la naissance. Le locus béta comporte plus de gêne à causes des duplications. Ces gènes sont tous exprimer au cours du développement à un moment ou à un autre. Les chaine ζ et ε forme des Hb embryonnaire dans foie. Chaines γ avec ζ 2- γ2 ou ε2- γ2 puis apparition des Hb fœtale dans la rate qui est α2- γ2. Hb adulte dans la Mo.O qui est α2- β2 ou Hb2 qui est δ2- α2.

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Le foie est l’organe hématopoïétique lors de l’embryogénèse. Ensuite la rate prend le relais. Et pour finir la Mo.O devient l’organe sécréteur au cours de la vie.

IV - Structure de la myoglobine et des hémoglobines Les myo- et hémoglobines sont des hétéroprotéines. Les globines sont liées à un facteur liant l’O2 : l’hème. Elle ont une structure dans l’espace commune car proviennent d’un gène ancestral commun. Celle-ci est constituée de Protoporphyrine 9 et de fer. Elle est inclut dans le globine par l’intermédiaire d’une poche et par la liaison entre l’atome de fer et des AA de la chaine protéique. L’organisation spatiale de la myoglobine et des chaînes α et ß est très proche. L’homologie en acides aminés est pourtant faible < 50%. Certains acides aminés sont cependant invariants entre les différentes chaînes de globines. 1. Module protéique de base Assemblage d’hélice alpha avec l’hème au centre dans une poche. Hémoglobine Myoglobine  leghémoglobine 2. Les globines sont des protéines globulaires Composé de 8 hélices α (75% des AA) de 7 à 28 acides aminés, pas de feuillet béta dans les globulaires. L'étude de la composition en acides aminés montre un type amphiphile: o Des acides aminés chargés exposés à la surface. o Une crypte apolaire contenant l’hème = poche Les acides aminés apolaires/hydrophobes favorisent les mouvements d’électrons capitaux pour la fixation de l’oxygène. 3. La myoglobine C’est une chaine unique de 153 AA, c’est donc un monomère contenue dans une sphère elliptique : 45x35x25 Å. Elle pèse 16 700 daltons et possède 8 hélices α (A-H). On la retrouve au niveau des muscles squelettiques et cardiaque. Elle a des concentrations plus élevées chez les mammifères marins. Histidine F8 (liaison avec l’hème) et E7 (module l’accès du Fer ou l’O2 avec l’inclinaison de la liaison qui au cours de l’évolution a diminué l’affinité du CO qui est très toxique) : présente dans les chaine alpha des myoglobines au niveau de la liaison avec l’hème.

La myoglobine fixe l’oxygène avec une cinétique « michaelienne » : Il y a un point de demi-saturation. Au niveau de la pression artérielle, la saturation de myoglobine est de 100%. Dans les tissus, la saturation en O2 est plus faible. La myoglobine peut quand même capter l’O2 dans des tissus qui ont une faible teneur en O2. Hb très affine pour le O2.

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V – Structure de l’hémoglobine Deux chaînes α et deux chaînes ß associées en un tétramère. C’est une hétérP à deux sens. Il y a :  141 résidus pour la chaîne α et  146 résidus pour la chaîne ß Le tétramère est de structure sphéroïde et mesure 64 x 55 x 50 Å. On peut avoir des interactions α1-ß1 qui impliquent 35 acides aminés et des interactions α1-ß2 impliquent 19 acides aminés. Les interactions sont essentiellement hydrophobes, quelques liaisons hydrogènes et ioniques. Important pour le changement de conformation qui peut être modifié en fonction du pH. 1. Organisation des globines A: Bleu, B: Bleu, C: Vert, D: Vert pale (sauf pour α), E: Jaune, F: Orangé, G: Rose, H: Rouge Il y a une cavité au centre du tétramère, qui est le site de fixation de l’O2. Il y a 8 hélices α dans une chaine de globine béta et 7 hélice α dans une chaine alpha. Une hélice a été perdu. E7 = histidine en position 7 sur la chaine E.

Pour des pression partielle en O2 importante, dans les tissu, la saturation est complète pour la myoglobine mais moins pour l’Hb La fonction principale de l’hémoglobine est le transport du O2. En bleu : même saturation pour l’Hb sans coopération. On observe un changement de conformation dans l’espace du tétramère d’Hb. La myoglobine aux pressions partielles équivalente est beaucoup plus affine que l’Hb. La forme sans coopérativité est beaucoup moins affine pour l’O2. La courbe de l’hémoglobine est sigmoïde alors que pour les formes monomériques elle ne l’est pas ce qui témoigne d’une moins forte coopération.

2. Organisation modulaire des globines en unités fonctionnelles Les AA de l’hème sont commun aux AA des chaine α1-β1 et α1-β2. 4 domaines : M1,M2, M3, M4. M2 et M3 interaction avec l’hème. Les domaines M2 et M4 sont impliqué dans les interactions α1β2 et les domaines M2, M3, et M4 dans α1-β1. On a des régions apparentées. Il y a une organisation en 3 exons.

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VI- L’hème Elle n’est pas un composé protéique. Il s’agit d’un groupement prosthétique (= non protéique) qui permet la liaison de l’O2 par l’intermédiaire d’un atome de fer. C’est cette molécule qui donne leur teinte à l’hémoglobine et la myoglobine : rouge quand elle est saturé et rouge foncé quand elle est dé saturé en O2. Elle est constituée de deux éléments: - la protoporphyrine IX lié par des liaisons covalentes au groupement propionates (noyau carbonné). - un atome de fer (Fe++) qui peut lier l’O2 : liaison de covalence à des atomes d’azote de la protoporphyrine et de coordinance. 1. Liaison de l’hème à la chaine de globine L’hème est intégré à une molécule de globine pour former l’Hémoglobine : Seuls les groupements propionates (chargés) de l’hème sont exposés à la surface de la molécule d’hémoglobine pour permettre les interactions avec le milieu aqueux. Le fer possède 4 points d’ancrage aux atomes d’azote de la protoporphyrine IX par des liaisons de covalence. Le fer possède deux possibilités supplémentaires d’établir des liens: les cinquièmes et sixièmes positions de coordination. La liaison Fe/His(F8) est une liaison covalente dative. La liaison F8 est invariante. L’histidine E7 va masquer le site de fixation de l’O2. Le pyrrole est un hétérocycle sur lequel on a des acides propionique et autres. Entre chaque pyrrole on a un C qui permet de les lié ensemble. R1 : propionate : exposé R2 : à l’intérieur de la molécule car sont hydrophobes.

2. Propriétés et structure de l’hème La liaison entre l’oxygène et le fer forme un angle. L’histidine E7 diminue également l’affinité de l’atome de fer et donc de l’hème pour le CO en favorisant une forme angulaire de la liaison Fe/CO. Dans la forme oxydée du fer (Fe3+), on a la méthémoglobine où le fer lie une molécule d’eau. L’atome de fer se situe entre l’histidine F8 et E7. La P9 n’est pas plane lorsqu’elle est fixée aux His. Le fer est orienté vers His F8 en l’absence d’O2, distant de 0.4Å. Quand il y a fixation d’O2, le fer se place dans le plan de la P9. Il y une attraction du fer vers l’O2 ce qui déplace l’His F8 qui est attiré. C’est ce déplacement qui explique le phénomène de coopération.

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VII – Fonctions de l’hémoglobine Ce changement de conformation a été observé par des courbe de saturation qui sont sigmoïde. Transport de l’oxygène : La réaction de dissociation de l’O2 et de l’Hb a été établie par Bohr : cela a été observé dans des tissus et est important pour l’échange. pO2 importante dans les poumon et plus faible dans les tissu. De ce fait on aura des saturations moins importantes dans les tissus. L’Hb pourra donc libérer l’O2 au niveau des tissus qui ont une saturation plus faible. Le transfert du fer se fait de l’Hb vers la myoglobine qui va le capter et le libérer dans les organes en besoin. Le pH va moduler l’ampleur du phénomène de coopérativité.

1. Courbe de dissociation P + nS  PSn Equation de Hill n : stœchiométrie (4 pour le O2) Coefficient de Hill : n reflète la coopérativité et varie entre 2,4 et 2,9. Cette valeur change beaucoup in vivo puisqu’elle varie en fonction de la température, de la PCO2 et du pH (=effet Bohr). Y est la saturation de l’hémoglobine. Hill montre la relation (PO2/P50)n = YO2/(100-YO2) P50 : la moitié des sites de fixation de l’Hb sont occupé par le O2. Cela correspond au point d’inflexion. Sa valeur standard au niveau de la mer est de 26,3 mmHg.

2. Coopérativité Conditionné par le repositionnement de l’atome de fer dans le noyau tétrapyrrolique. (P9) L’hélice F qui contient HisF8 change de position ce qui entraine un repositionnement des autres hélices et notamment l’hélice H. La chaine F et H vont se modéliser dans l’espace. Oxyhémoglobine varie de 15° l’axe de la molécule après fixation de 4 atomes de fer par rapport à la désoxyhémoglobine.

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Forme T (tense) est la forme désaturé qui va subir une rotation de 15° pour se retrouver sous la forme R (=saturé). Il y a fermeture de la partie centrale qui empêche la fixation du 2-3BPG. La forme R est la forme relaxed, il y a augmentation de la distance entre α1 et β1.

Caractéristique du tétramère :

T

R

Il y a un déplacement du fer de 0.4 Å ce qui entraine des modifications des distances entre les différentes chaines avec un degré de variation de 15°. 3. Effet de Bohr = effet du pH sur les Tissus La baisse du pH diminue l’affinité de l’O2 pour Hb. La pO2 diminue également et surtout dans les tissus. La myoglobine est monomérique et ne subit pas les variations de pH. 

Quand le pH baisse, l’Hb libère l’O2 via le muscle qui libère de l’acide lactique et du CO2 ce qui permet la libération de l’O2, à des pressions équivalente.

A pH 7.4 on a 80% de différence de saturation entre la myoglobine et l’Hb dans les tissus, on peut atteindre 90% de différence si on diminue encore le pH. 4. Effet Haldane

La désoxygénation modifie le transport du CO2 par l’Hb. Le CO2 se fixe sur la chaine de la globine pour former la carbamino-globine (10% du CO2). Les ions H+ se fixe sur l’Hb et forme l’effet Bohr ce qui entraine la formation de bicarbonates HCO3-. Le CO2 est transporté sous forme dissoute dans le sang = bicarbonates : 75% et est transporté sous forme normale dans Hb : 10% du CO2. Ce n’est pas l’inverse de l’effet Bohr. Dans le tissu, la molécule est désaturé donc fixation du CO2 sur l’Hb et mauvaise fixation dans le poumon car elle est saturé.

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5. Echange GR-tissu et Hb On a une molécule d’eau qui va former des bicarbonates avec le CO2 via l’anhydrase carbonique. Celui-ci est exporté contre un atome de Cl. Les protons restent dans le GR. La formation de carbamino-Hb libère des protons et de l’O2. Les protons entraine la baisse du pH dans le globule rouge ce qui entraine l’effet Bohr. On a donc libération de l’O2.  Plus on libère de CO2, plus on baisse le pH, plus on peut libérer du O2 dans les tissu  cycle vertueux.

a) La carbamino-Hb L’Hb a fixé en amino-term un CO2 et libéré un H+. La carbamino-Hb favorise la transition vers la forme T de l’Hb ce qui entraine la libération de l’O. Les protons se lient à certain AA de l’Hb favorisant sa forme T et entraine la libération de l’O. Ils participent également à l’effet Bohr et contribue à la libération du O2. 6. Régulation métabolique de la fixation de l’O a) Par le 2.3BPG Il provient de la conversion du 1.3BPG (biphosphoglycérate) qui possède de nombreuses charges négatives. Les GR réalisent encore la glycolyse permettant cette transformation malgré qu’elles soient dépourvues d’organites. Il se lie à la forme T désoxyHb. La poche centrale est accessible et lie cette molécule de 2.3BPG. Cette liaison entre les chaines β entraine une diminution de l’affinité pour l’O2 en favorisant la forme T donc l’état désaturé de l’H b (donc libération).  Participe à l’augmentation de l’effet Bohr par diminution du pH. En l’absence de 2.3BPG, seul 8% de l’O2 est libéré. Sans ce système de formation on aurait de moins bonne capacité à restituer l’O2 capturé au niveau des alvéoles au tissu.

Hb fœtale à moins d’affinité pour le 2.3BPG (absence de capacité à lier le 2.3BPG), et elle est donc plus affine pour l’O2. Pour les mêmes pressions on a une meilleure saturation de l’HbF que l’Hb normale.

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Les interactions impliquent uniquement les chaines de globine β et les AA suivants : His 143, Lys 82, His 2 qui sont responsable de la liaison. Il y a une symétrie du fait de la configuration anti// des chaines. On dit qu’elles sont tête bèche. Le 2-3BPG expose ces phosphates à la surface. Il peut y avoir des mutations pour des patients qui ne fixeraient plus ce 2-3BPG.

b) Structure de l’Hb Hb embryonnaire : α2ε2 présente une meilleure affinité pour l’O2 tout comme l’Hb fœtale α2γ2 (affinité augmenté pour le O2), les chaines gamma ne fixent pas le 2-3BPG. La circulation maternelle est mise en rapport avec la circulation fœtale ce qui permet les échanges de gaz. Meilleur affinité de HbF pour l’O2 ce qui permet d’oxygéner le fœtus. Il relargue ensuite le O2 dans ces tissu qui est capté par la myoglobine fœtale.

c) Régulation de la synthèse de 2-3BPG 16 La concentration varie avec les conditions métaboliques : o Augmente lors de l’hypoxie (diminution des apports en O2, glycolyse augmente, milieux anaérobie). o Augmente lors de l’alcalose (moins d’effet Bohr). Pour contrebalancer cette meilleur affinité de l’Hb pour l’O2, on augmente la concentration de 2-3BPG, on libère des protons. Il n’y a pas de feed-back (pas d’équilibre) de production car il est lié à l’Hb. Si on augmente pas la pression partielle en O2, le 2-3BPG reste coincé dans la poche et empêche l’Hb de refixer de l’O2.

VIII – Relation structure-fonction L’hémoglobine existe, au moins, sous deux formes qui dépendent des AA et des pont ioniques: o T (t e n s e) : désoxyhémoglobine, la valine E11 de la chaîne ß empêche la fixation de l’oxygène sur le Fe2+, la structure T est stabilisée par un réseau de ponts salins. Encombrement supérieur à cause de cette Valine. o R (r e l a x e d) : oxyhémoglobine. Site plus « ouvert » et 500 fois plus affine pour l ’O2.

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1. Localisation des ponts-salins 

Il y en a 5 au total et 10 avec la symétrie qui stabilise la structure de la protéine, du tétramère. Les chaines sont orienté de façon tête bêche les unes aux autres.





Inter-chaine o entre acide carboxylique en position C-term de la chaine β et la Lys40 de la chaine α. o Entre Asp126 et l’Arg141 des chaines α. o Entre les extrémité des chaines (N-term et C-term) Intra-chaine entre Asp94 et His146 de la chaine β.

IX – Modélisation C’est le substrat qui va équilibrer les formes. On ne sait pas encore lequel des modèles est réalisé. Concerté : Saturation induite qui induit changement brutale de conformation ou changement graduelle en R ou T Séquentiel : une protéine change de forme, puis une 2ème et une 3ème  le + fréquent

X- Les autres formes de l’Hb o o o o

1.

Oxyhémoglobine = saturé en O2 Désoxyhémoglobine = désaturé Méthémoglobine = fixe de l’eau et non l’O2. On a un atome de Fe3+ (ferrique). Carboxyhémoglobine = porte du CO et non du O2, fixation sur le même site donc compétition entre les deux sur l’atome de Fer de l’hème. Autant de CO que de O2 se fixe sur un atome de Fe2+.

formes

Occurrence de ces de l’hémoglobine

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a) Méthémoglobinémies: Elle est présente si il y a plus de 1% de Fe3+.  Signe clinique important, les patients présentant une forte quantité de MHb ont une cyanose intense bleue ardoisée, une faiblesse musculaire et peuvent avoir des syncopes. La présence de cette molécules peut être du : o Mutations méthémoglobisantes o Altération du métabolisme du glutathion : il capte les radicaux libres o Toxiques: Borates, bromates, nitrites…et médicaments. 2.

Carboxyhémoglobine

Le CO a une affinité pour l’hème 210x supérieure à celle de l’O2. Le CO au...